鸡新城疫-禽流感（H9亚型）二联灭活疫苗（La Sota株+HP株）的灭活试验

陈慧婧 福州大北农生物技术有限公司 福州 350014

新城疫（Newcastle disease，ND）又名亚洲鸡瘟，是由新城疫病毒（Newcastle disease virus，NDV）引起鸡的一种以呼吸困难、黏膜及浆膜出血、高热、下痢、神经紊乱为特征的禽类高度接触性急性传染病[1]。禽流感 （Avian Influenza，AI）是由禽流感病毒引起鸡、火鸡、鸭、鹌鹑和鹅及水禽、野鸟等患病的传染性疾病，禽流感又被称为真性鸡瘟或欧洲鸡瘟[2-3]。新城疫和禽流感是危害养禽业的主要病毒性疫病，在规模鸡场中常混合感染或继发感染。免疫接种仍然是防控该病的主要措施，鸡新城疫-禽流感 （H9亚型）二联灭活疫苗得到了广泛应用。作为灭活疫苗，灭活过程事关生物安全，灭活不彻底存在散毒的风险，但加入过量的灭活剂又会影响疫苗的免疫效果。本试验通过对两种抗原用不同浓度的甲醛灭活剂量和不同灭活时间，检测灭活效果和血凝价变化，筛选出最适合的甲醛灭活浓度和灭活时间。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 病毒 新城疫病毒 （La Sota株） 抗原BS2016005批、禽流感病毒（H9亚型 HP株）抗原BS2016003批，由福州大北农生物技术有限公司提供。

1.1.2 试验动物 非免鸡胚，由扬州康威提供，福州大北农生物技术有限公司进行孵化至10日龄。

1.1.3 主要试剂 生理盐水、青霉素链霉素溶液（1万单位/mL）、1%鸡红细胞悬液为福州大北农生物技术有限公司配制；甲醛溶液为三明市三圆化学试剂有限公司产品。

1.2 试验方法

1.2.1 灭活 用37%甲醛溶液灭活，按最终浓度分为①组0.1%甲醛溶液、②组0.2%甲醛溶液、③组0.4%甲醛溶液、④组0.8%甲醛溶液。分别取新城疫抗原和禽流感抗原，用灭菌的四层纱布过滤，去除尿囊液中的杂质，将过滤后的抗原准确称量后置于灭菌玻璃瓶内。将灭活剂缓缓加入抗原中，边加边摇晃使其充分搅拌均匀。加完灭活剂后需用灭菌纱布蘸取灭活剂擦拭瓶口和瓶颈内壁，避免瓶颈附近在抗原接触不到灭活剂而导致灭活不彻底。充分混匀后置于37℃温室中，期间每隔4 h摇匀一次，使其温度均匀，灭活剂和抗原均匀接触。待抗原达到37℃开始计时，分别在 10 h、12 h、14 h、16 h、18 h、24 h、30 h、36 h、42 h 取样。

1.2.2 灭活效果评价

1.2.2.1 灭活检验

1.2.2.1.1 准备 1 mL注射器（带5#针头），标记好气室及接种位的10日龄SPF鸡胚12枚。

1.2.2.1.2 消毒 消毒SPF鸡胚气室及腔接种位，并在气室及接种位上打孔。

1.2.2.1.3 接种 将待检样品接种SPF鸡胚，每枚胚分别尿囊腔接种待检灭活胚液0.2 mL，每个样品接种12枚SPF鸡胚。

1.2.2.1.4 照蛋 24 h后开始照蛋，每天照蛋2次，观察5 d。

1.2.2.1.5 HA测定 对所有胚液分别测定红细胞凝集价。

1.2.2.1.6 判定 鸡胚非特异性死亡不应超过1枚，鸡胚均无血凝出现，认为灭活完全。当HA结果有可疑时，应将可疑胚液按上述方法进行重检，重检不合格则说明灭活不彻底。

1.2.2.2 血凝价测定 取各甲醛浓度各灭活时间的样品进行血凝价测定，同时留取新城疫病毒（La Sota株）抗原BS2016005批和禽流感病毒（H9亚型HP株）BS2016003批灭活前的样品作对照。

3 结果与分析

3.1 灭活检验

3.1.1 新城疫病毒灭活检验结果 新城疫病毒经不同浓度甲醛灭活不同时间的效果见表1。经0.1%、0.2%甲醛溶液灭活16 h可以达到100%灭活效果，0.4%甲醛溶液灭活14 h达到100%灭活效果，0.8%甲醛溶液灭活10 h病毒全部死亡。从表1鸡胚死亡比例可以看出，随着甲醛浓度增加，病毒灭活速度加快。

表1 新城疫抗原灭活检验结果

3.1.2 禽流感病毒灭活检验结果 禽流感病毒经不同浓度甲醛、灭活不同时间的效果见表2。经0.1%、0.2%甲醛溶液灭活16 h可以达到100%灭活效果，0.4%甲醛溶液灭活14 h达到100%灭活效果，0.8%甲醛溶液灭活12 h达到100%灭活效果。从表2鸡胚死亡比例可以看出，随着甲醛浓度增加，病毒灭活速度加快，病毒全部灭活也随着甲醛浓度增加而缩短时间。

表2 禽流感抗原灭活检验结果

3.2 不同浓度甲醛对血凝活性影响

3.2.1 不同浓度甲醛对新城疫病毒 （La Sota株）血凝活性影响 不同浓度的甲醛灭活新城疫病毒，灭活不同时间的血凝价见表3。由数据可以看出，新城疫病毒血凝活性受甲醛浓度和灭活时间影响较大，0.8%浓度的灭活影响最大，10 h时血凝价降低了6个滴度，到16 h时已经没有血凝活性；0.1%和0.2%相对接近，18 h前只降低了2个滴度，到48 h也降低了4～5个滴度，0.1%比0.2%稍好；0.4%到16 h已经降低了4个滴度，到48 h只剩22。由此可见，新城疫病毒受甲醛浓度和灭活时间影响很大，浓度越大、时间越长，影响越大。

3.2.2 不同浓度甲醛对禽流感病毒 （H9亚型HP株）血凝活性影响 不同浓度的甲醛灭活禽流感病毒，灭活不同时间的血凝价见表4。由数据可以看出，禽流感抗原灭活前血凝是29，4组不同浓度及不同时间的血凝价全部是28。由此可见，禽流感病毒血凝活性受甲醛浓度和灭活时间的影响不大。

表3 甲醛对新城疫病毒血凝活性影响

表4 甲醛对禽流感病毒血凝活性影响

3 讨 论

灭活工序是灭活疫苗生产中最重要、最关键的生产环节之一，抗原灭活的效果与灭活剂关系重大，如果灭活不彻底存在散毒的风险。甲醛是应用最广泛的灭活剂，其普遍应用于动物灭活疫苗的生产中。甲醛的浓度、作用时间、温度等条件是影响灭活效果和抗原损失的重要因素[4]。灭活疫苗生产中病毒灭活不彻底将造成灾难性的影响，所以，在灭活时，有的会加入超量的灭活剂。田国斌等认为禽流感病毒在灭活时使用超量的甲醛溶液，病毒的保护性抗原会被破坏，对免疫效果会造成不良影响[5]。有关试验证明疫苗中血凝素的含量与免疫后的抗体水平和攻毒保护率有密切关系。所以，本试验对两种抗原用不同浓度的甲醛和不同的时间进行灭活研究，观察不同浓度甲醛对病毒的灭活效果以及对血凝活性的影响。

新城疫病毒经0.1%和0.2%甲醛灭活16 h，病毒全部死亡；0.4%和0.8%甲醛分别在14 h和10 h病毒全部死亡。而新城疫病毒的血凝活性对甲醛比较敏感，0.8%甲醛浓度到16 h已经没有血凝价，0.4%浓度也使血凝价下降很多，到16 h已经下降了4个滴度，到48 h只剩22，0.1%和0.2%甲醛浓度在18 h前血凝价只降低2个滴度，随着时间延长到48 h也降低了4～5个滴度。田国斌等认为甲醛浓度的高低直接影响鸡只接种部位的刺激和损伤大小，从而影响疫苗的吸收和免疫效果[5]。在保证病毒全部被灭活的前提下，选择甲醛含量尽量低、血凝活性尽量高、灭活时间尽量短的条件。从试验结果得出，新城疫病毒最适合的甲醛浓度为0.1%，灭活时间为16 h。

禽流感病毒经0.1%和0.2%甲醛灭活16 h，病毒全部死亡；0.4%和0.8%甲醛分别在14 h和12 h病毒全部死亡。禽流感病毒的血凝活性受甲醛影响不大，灭活前血凝活性为29，而4个浓度的不同灭活时间，血凝活性全部为28，经过灭活只下降了1个滴度。从试验结果得出，禽流感病毒用0.1%甲醛浓度进行灭活16 h，病毒全部死亡，但是禽流感病毒很容易变异，为确保灭活效果，批量生产时可将禽流感病毒灭活时间定为18 h。