HPLC法同时测定康溃丸中黄芪甲苷藁本内酯和党参炔苷的含量

孙莹莹

摘要：目的 建立HPLC法同时测定康溃丸中黄芪甲苷、藁本内酯、党参炔苷的含量的方法。方法 采用高效液相色谱法，色谱条件：Agilent Zorbax Eclipse XDB-C18色谱柱（4.6 mm×250 mm，5μm）;混合流动相：流动相A为乙腈，流动相B为0.25 moL·L-1三氟乙酸水溶液，梯度洗脱;流速：1.0 mL·min-1;柱温：28℃;进样量：10μL;检测波长：282nm。结果 黄芪甲苷、藁本内酯、党参炔苷检测质量浓度线性范围分别为2.256～32.158 μg·mL-1，2.268～58.142 μg·mL-1，2.284～46.524 μg·mL-1。平均加样回收率（RSD）分别为100.95（0.88）、99.42（1.06）、99.42（0.92）。结论 该方法简单快速、准确可靠、专属性、精密度、稳定性、重复性均较好，为康溃丸质量标准的提高提供有意义的实验基础。

关键词：康溃丸;黄芪甲苷;藁本内酯;党参炔苷;HPLC

中图分类号：R927.2   文献标志码：A   文章编号：1007-2349（2019）06-0078-04

【Abstract】Objective：To establish a HPLC method for simultaneous determination of the contents of astragaloside，ligustilide and codonopsis in Kangchuan Pills.Methods：HPLC was used with chromatographic conditions，Agilent Zorbax Eclipse XDB-C18 column（4.6 mm×250 mm，5 μm）.Mixed mobile phase：mobile phase A was acetonitrile and mobile phase B was 0.25 moL·L-1 aqueous solution of trifluoroacetic acid.gradient elution，1.0 mL·min-1 of flow rate，28°C of column temperature，10 μL of injection amount and 282 nm of detection wavelength.Results：The linear range of the detection quality concentration of astragaloside，ligustilide and ginsenoside were from 2.256 to 32.158 μg·mL-1，2.268 to 58.142 μg·mL-1 and 2.28 to 46.524 μg·mL-1，respectively.The average sample recovery（RSD）was 100.95（0.88），99.42（1.06），and 99.42（0.92），respectively.Conclusion：The method is simple，rapid，accurate and reliable，and has good specificity，precision，stability and repeatability and provides a meaningful experimental basis for the improvement of Kangkui Pill quality standard.

【Key words】Kangkui Pills，astragaloside，ligustilide，cognac glucoside，HPLC

康潰丸是南京中医药大学附属连云港医院生产的医疗机构药物制剂，批准文号：苏药制字Z04000051，该药物由黄芪、当归、党参、丹皮、赤芍、白芍、生地黄、麦冬、玄参、甘草等药味制成，具有益气养血、滋阴降火、清热解毒、活血止痛生肌的功效，主治复发性口腔溃疡。目前对康溃丸的质量控制方法主要是薄层鉴别法，主要是对其含有的重要药材进行定性鉴别，没有对主要活性成分进行含量测定的方法，这对与康溃丸的质量控制是十分不利的，所以，建立对康溃丸主要活性成分的含量测定方法，是该药物质量控制中亟待解决的技术问题。康溃丸处方中，黄芪为君药，当归、党参为臣药，黄芪甲苷是黄芪中的含有的重要活性成分，藁本内酯是当归中含有的重要活性成分，党参炔苷是党参中含有的重要活性成分，故建立高效液相色谱法对黄芪甲苷、藁本内酯和党参炔苷三种指标性活性成分进行含量测定，是一种有效控制康溃丸质量的方法，笔者对此进行了研究，为更有效地控制康溃丸的质量提出一定的实验基础。

1 材料

1.1 仪器 Agilent 1200型HPLC仪，包括四元泵、紫外可变波长检测器、自动进样器、ChemStation化学工作站（美国Agilent公司）;JA2003型电子天平（上海上天精密仪器有限公司）;KQ-800ES型高效能超声波清洗器（苏州江东精密仪器有限公司）;TG18-WS型台式多功能高速离心机（长沙维尔康离心机有限公司）。

1.2 试药 康溃丸，由黄芪、当归、党参、丹皮、赤芍、白芍、生地黄、麦冬、玄参、甘草等药味制成，由南京中医药大学连云港附属医院制备。黄芪甲苷对照品（批号：101106-201702）;藁本内酯对照品（批号：121030-201703）;党参炔苷对照品（批号：110521-201701），均购于中国食品药品检定研究院。乙腈为色谱纯（Fisher公司）;三氟乙酸均为分析纯（枣庄润发化工有限公司）;水为超纯水。

2 方法与结果

2.1 色谱条件 Agilent Zorbax Eclipse XDB-C18色谱柱（4.6 mm×250 mm，5μm）;混合流动相：流动相A为乙腈，流动相B为0.25 moL·L-1三氟乙酸水溶液，梯度洗脱，洗脱顺序见表1;流速：1.0 mL·min-1;柱温：28℃;进样量：10μL;检测波长：282nm。

2.2 混和对照品溶液的制备 精密称取黄芪甲苷对照品6.00 mg，藁本内酯对照品12.00 mg，党参炔苷对照品8.00 mg，分别置于25 mL量瓶中，加甲醇溶解并定容，摇匀，即得黄芪甲苷对照品贮备液、藁本内酯对照品贮备液、党参炔苷对照品贮备液;分别精密量取3种对照品贮备液各2.0 mL，置于同一10 mL量瓶中，加甲醇稀释定容，制成含黄芪甲苷、藁本内酯、党参炔苷质量浓度分别为48.00 μg·mL-1、96.00 μg·mL-1、64.00 μg·mL-1的混和对照品溶液。

2.3 供试品溶液的制备 取康溃丸样品20丸，研成细粉，称取1.0 g，精密称定后，置于具塞锥形瓶中，精密加入甲醇50 mL，密塞，称定质量，超声提取，超声功率：250 W，超声频率：40 kHz，超声时间：40 min，冷却后，以5000 r·min-1的速度，离心10 min，取上清液，用水饱和的正丁醇萃取2次，每次30 mL，合并正丁醇液，蒸干，残渣用0.25 moL·L-1三氟乙酸水溶液溶解，定容至10 mL量瓶中，摇匀，离心5 min，取上清液，经0.45 μm微孔滤膜滤过，取续滤液，即得供试品溶液。

2.4 阴性對照品溶液的制备 将康溃丸处方中黄芪、当归、党参三味药材原料去除后，再按照康溃丸的制备工艺制成不含黄芪、当归、党参三味药材原料的药物，再按照本研究提供的供试品溶液的制备方法，制成即阴性供试品溶液。

2.5 专属性试验 取混合对照品溶液、供试品溶液、阴性对照溶液各适量，在本研究提供的色谱条件进样测定，记录高效液相色谱图，结果见图 1。实验结果表明，阴性对照在与黄芪甲苷、藁本内酯、党参炔苷保留时间相同处无其他色谱峰的干扰，表明本实验的专属性良好。

2.6 线性关系考察 分别精密吸取混合对照品溶液0.5 mL，1.0 mL，2.0 mL，4.0 mL，8.0 mL，分别置于10 mL量瓶中，加入体积比为20：80的乙腈-0.25 moL·L-1三氟乙酸水溶液定容，制成系列混合对照品溶液。精密量取上述系列混合对照品溶液各10 μL，在本研究提供的色谱条件下，注入高效液相色谱仪，进行测定，以黄芪甲苷、藁本内酯、党参炔苷的质量浓度（X，μg/mL）为横坐标、以高效液相色谱峰的峰面积面积（Y）为纵坐标进行线性回归，记录色谱图，绘制标准曲线，计算得到线性回归方程，见表2。

实验结果表明：黄芪甲苷、藁本内酯、党参炔苷检测质量浓度线性范围分别为2.256～32.158 μg·mL-1，2.268～58.142 μg·mL-1，2.284～46.524 μg·mL-1。

2.7 定量限与检测限考察 分别精密量取混合对照品溶液适量，倍比稀释，在本研究提供的色谱条件下，注入高效液相色谱仪，进行测定，当信噪比为10：1时，得定量限;当信噪比为2：1时，得检测限。实验结果得出，黄芪甲苷的定量限分别为2.438 μg·mL-1，检测限为1.218 μg·mL-1;藁本内酯的定量限分别为2.528 μg·mL-1，检测限为1.324 μg·mL-1;党参炔苷的定量限分别为2.446 μg·mL-1，检测限为1.352 μg·mL-1。

2.8 精密度试验 精密吸取混合对照品溶液10 μL，在本研究提供的色谱条件下，在12 h内连续进样6次，进行测定，记录高效液相色谱峰的峰面积。测得黄芪甲苷、藁本内酯、党参炔苷的峰面积自然对数RSD分别为0.387%、0.49%、0.65%，表明精密度良好。

2.8 稳定性试验 取供试品溶液（批号：20180510）10 μL，在本研究提供的色谱条件下，分别于0.5 h、1 h、2 h、4 h、8 h、16 h进样测定，记录高效液相色谱峰的峰面积。测得黄芪甲苷、藁本内酯、党参炔苷峰面积自然对数RSD分别为0.68%、0.95%、0.74%（n=6），表明供试品溶液在室温条件下，16 h内稳定性良好。

2.9 重复性试验 精密量取同一批号的康溃丸（批号：20180510）100丸，研细，将细粉均分为6份，按本研究提供的方法制备供试品溶液，在本研究提供的色谱条件下进样10μL测定，记录高效液相色谱峰的峰面积并计算含量。测得康溃丸中黄芪甲苷、藁本内酯、党参炔苷含量平均值分别为 245.85 μg·g-1、495.26 μg·g-1、370.58 μg·g-1，RSD分别为0.75%、0.84%、0.66%（n=6），表明本方法重复性良好。

2.10 加样回收率试验 精密称取已知含量的康溃丸（批号：20180510）6份，每份1.0 g，分别精密加入低、中、高3种质量浓度的混合对照品溶液，按本研究提供的方法制备成待测供试品溶液，在本研究提供的色谱条件下，进样10 μL进行测定，记录高效液相色谱峰的峰面积，并计算加样回收率，结果见表3。

2.11 样品含有量测定 取3批次的康溃丸，每批次精密称取50 mL，按本研究提供的方法制备供试品溶液，在本研究提供的色谱条件下，精密吸取10 μL进样测定，计算含量，平行3次，测定结果见表3。

3 讨论

3.1 供试品溶液制法的考察 参考相关文献[1-3]，本研究以水、甲醇、0.25 moL·L-1三氟乙酸水溶液为提取溶剂，对超声提取、回流提取进行了考察，并对萃取溶剂也进行了实验，实验结果表明，采用甲醇为溶剂，超声提取时藁本内酯的含量较回流提取时的含量高，这可能与藁本内酯具有挥发性，回流提取可能有部分损失有关，故选择甲醇为溶剂，超声提取为本试验的提取方法;分别考察了以水饱和的正丁醇萃取和以丙酮溶剂萃取，结果显示，以水饱和的正丁醇萃取时，黄芪甲苷、藁本内酯、党参炔苷含量最高，色谱中杂质峰最少，故确定水饱和的正丁醇为本试验的萃取溶剂。

3.2 流动相的考察 考察了甲醇-水、乙腈-0.25 moL·L-1三氟乙酸水溶液、乙腈-0.25 moL·L-1磷酸二氢钠水溶液等多种不同浓度和比例的流动相系统，实验结果表明，以乙腈-0.25 moL·L-1三氟乙酸水溶液为流动相，梯度洗脱时，黄芪甲苷、藁本内酯、党参炔苷分离效果好，峰型对称，出峰稳定，干扰少，故采用乙腈-0.25 moL·L-1三氟乙酸水溶液为流动相体系。

3.3 检测波长的考察 采用紫外可变波长检测器200～380 nm范围内对黄芪甲苷、藁本内酯、黨参炔苷这3个成分进行扫描，黄芪甲苷在306 nm、282 nm处有最大吸收，藁本内酯在282 nm、334 nm处有最大吸收，党参炔苷在281 nm、254 nm处有最大吸收，结合相关文献[4-6]，当检测波长为282 nm时，黄芪甲苷、藁本内酯、党参炔苷这3个成分均有较大吸收峰，故选择检测波长选择在282 nm。

4 结论

本实验建立HPLC法同时测定康溃丸中黄芪甲苷、藁本内酯、党参炔苷的含量，该方法简单快速、准确可靠、专属性、精密度、稳定性、重复性均较好，为康溃丸质量标准的提高提供有意义的实验基础。

参考文献：

[1]李春花.HPLC法测定欣康胶囊中黄芪甲苷的含量[J].山西中医，2017，33（7）：57-58.

[2]关潇滢，曾利娜，胡晓谕，等.高效液相色谱法同时测定六味补血胶囊中没食子酸、芍药苷和藁本内酯含量[J].中国药业，2018，27（5）：13-15.

[3]南国，张鹏，王萌，等.HPLC法测定稳心颗粒中三七皂苷R_1、人参皂苷Rg_1、Rb_1、Rd与党参炔苷的含量[J].天津中医药，2016，33（7）：434-436.

[4]叶绘晟，唐文均，龚志强，等.HPLC法测定泰痹颗粒Ⅱ号中虎杖苷、葛根素、黄芪甲苷含量[J].中药新药与临床药理，2018，29（2）：184-188.

[5]叶晓娅，薛晓会.HPLC法同时测定当归片中阿魏酸、洋川芎内酯Ⅰ和藁本内酯的含量[J].中国药品标准，2018，19（4）：295-298.

[6]李彩东，王信，潘新波，等.波长切换技术同时测定加味小柴胡汤胶囊中党参炔苷等4种成分[J].西部中医药，2017，30（1）：26-28.

（收稿日期：2019-03-19）