不同程度宫颈病变患者阴道微生物群落差异比较分析

梁文丽，谢爱香

(1．濮阳市中医医院妇产科，河南 濮阳457000；2．濮阳市中医医院检验科，河南 濮阳 457000)

宫颈癌是我国女性第二常见的恶性肿瘤之一，其发生情况占女性生殖系统恶性肿瘤的第一位，宫颈癌前病变是女性具有癌变可能，但临床尚未诊断为原位癌的宫颈异常增殖性病变，具有发展为恶性肿瘤的可能，患者长期存在可能会发展为宫颈癌[1-3]。宫颈上皮细胞暴露于阴道女性阴道微环境中，女性阴道微环境对保护其阴道微环境稳定具有至关重要的作用，故临床医务人员对阴道微生物在宫颈病变发展过程中是否具有一定作用仍存在疑问，既往研究中对阴道微生态的评价多依靠采集女性阴道分泌物涂片及结合阴道等功能性指标，但临床工作中会受到多种因素干扰进而影响结果情况[4-8]。本次研究选取濮阳市中医院妇科42例宫颈病变患者以及同期于濮阳市中医院进行健康体检的23例健康女性的临床资料进行回顾性研究分析，目的在于研究分析不同程度宫颈病变患者阴道微生物群落差异。

1 一般资料与方法

1．1 一般资料 选取 2017年 1月至 2018年 6月濮阳市中医院妇科42例宫颈病变患者作为研究对象，根据患者宫颈病变情况进行分组，其中22例宫颈上皮内瘤变Ⅰ级患者为观察A组，其20例宫颈上皮内瘤变Ⅱ/Ⅲ级患者作为观察B组；采取同期于濮阳市中医院进行健康体检的23例健康女性作为对照组。其纳入标准为：⑴观察组两组患者诊断符合 《宫颈病变以及宫颈癌检查教程》[9]中对宫颈上皮内瘤变诊断标准；⑵所有观察人员为已婚女性；⑶所有观察人员月经规律；⑷近1个月内无使用抗生素以及阴道冲洗药物；⑸所有观察人员近1周阴道无异常分泌物及流血；⑹所有观察人员近1周无性生活；⑺所有观察人员或家属知情并签署知情同意书，排除标准：⑴存在泌尿生殖器炎症；⑵存在糖尿病、心、肝等内科疾病；⑶具有长期使用皮质类固醇以及免疫抑制剂史。观察组A组患者平均年龄为41．24±1．27岁，观察组B组患者平均年龄为42．07±1．25岁，对照组患者平均年龄为41．54±1．31岁；比较三组患者平均年龄等一般资料差异不具有统计学意义（P＞0．05），具有可比性。本次研究内容经濮阳市中医院伦理学会批准执行。

1．2 方法 采用无菌棉拭子于所有研究人员阴道后穹窿处转动15s左右，待无菌棉拭子充分吸收研究人员阴道内分泌物后放入干燥无菌试管中，采集好的标本结束后放置于冰箱保存，用于细菌基因组提取。细菌基因DNA提取试剂盒采用德国进口试剂盒，其具体操作按照试剂盒说明书进行操作，提取结束后放置于冰箱进行保存。本次研究采用稀释提取的基因组为模板，其引物序列见表1。PCR产物使用琼脂糖凝胶进行电泳检测，并根据其PCR产物浓度进行等量混合。本次研究生物信息学分析选择MiSeq软件的默认指数对其原始测序数据进行测定，并去除其接头数列以及低质量数列的预处理，利用其命令进行对标本菌群的主成分分析以及不同组间群落结构以及菌群差异。

1．3 统计学方法 所有数据资料均采用SPSS 20．0软件对数据进行统计分析。计量资料数据行正态性和方差齐性检验，用均数±标准差（x±s）的形式表示，计数资料采用例数（%）的方式表示。组间计量资料比较采用独立样本t检验，计数资料组间比较采用χ2检验。P＜0．05为差异具有统计学意义。

2 结果

2．1 比较观察A、B两组与对照组多样性指数差异比较三组患者辛普森指数以及香农指数差异不具有统计学意义（P＞0．05）；比较三组患者 Chao 指数以及ACE指数差异具有统计学意义 （P＜0．05）；观察A组患者Chao指数以及ACE指数明显高于对照组，差异具有统计学意义（P＜0．05）；观察 B 组患者Chao指数以及ACE指数与对照组比较差异无统计学意义（P＞0．05）；见表 2。

表2 比较观察A、B两组与对照组多样性指数差异

2．2 比较三组患者菌群结构 检测三组患者菌群结构共23个菌门，其中对照组患者阴道菌群323080为厚壁菌门组成，占78．69%，65692为放线菌门，占16%；剩余 21个菌门占 5．31%（21801）；观察 A 组厚后壁菌门组成比例降低为254719，占64．86%，放线菌门增多至108823，占27．71%；剩余21菌门占比提高至29140，占7．43%；观察B组患者阴道菌门、菌属情况与对照组分布情况基本一致。观察B组与对照组均为以乳酸杆菌为主，存在256376，占比71．80%，加德纳菌属占比 12．91%，为 46091，奇异菌属仅占比3．29%，剩余菌属为普雷奥、奇异以及斯尼斯菌等，占比为12．00%；观察A组中，乳酸杆菌属含量下降至220945，占比56．26%；加德纳菌属上升至 76974．占 19．60%，其奇异菌属含量上升为30240，占7．7%剩余菌属为普雷奥、奇异以及斯尼斯菌等，占比为 16．44%．见图 1、图 2。

图1 三组患者菌门占比情况饼状图

2．3 菌群类型 阴道菌群通常分为4种，其中分别以卷曲乳酸杆菌、加氏乳酸杆菌以及惰性乳酸杆菌为优势菌，而各种厌氧菌组成的阴道菌群Ⅳ，比较三组患者阴道菌群类型差异无统计学意义 （P＞0．05）；见表 3。

表3 比较三组患者阴道菌群类型

3 讨论

宫颈癌是目前病因明确的妇科恶性肿瘤，与高危型人乳头瘤病毒的持续感染相关，但由高危型人乳头瘤病毒发展为宫颈癌需要经历较为漫长且可逆转的癌前病变期，虽在现代医疗水平下对于导致宫颈癌前病变进展的原因尚不明确，但由有部分报道表明阴道微生态的组成以及变化与宫颈癌前病变的进展具有一定相关关系[10-14]。采用传统的细菌培养对女性进行鉴定特异性细菌对多样性阴道微生态菌落上不全面[15，16]。随着现代医疗水平以及科技的不断发展，传统生物学技术耗时长、工作量大且不能完整反映等缺点逐一显现，而新兴技术具有成本低、操作简单等特点逐渐广泛运用于临床中，使关于不同程度宫颈病变患者引导微生物群落差异情况得到进一步研究[15，16]。

比较三组患者Chao指数以及ACE指数差异具有统计学意义（P＜0．05）；观察 A 组患者 Chao 指数以及ACE指数明显高于对照组，差异具有统计学意义（P＜0．05）；健康女性阴道菌群主要由厚壁菌门组成，以乳酸杆菌为主，与本次研究中结果一致，本次研究中检测三组患者菌群结构共23个菌门，其中对照组患者阴道菌群323080为厚壁菌门组成，占 78．69%，65692 为放线菌门，占 16%；剩余 21个菌门占5．31%（21801）；观察A组后壁菌门组成比例降低为254719，占64．86%，放线菌门增多至108823，占 27．71%；剩余 21菌门占比提高至29140，占7．43%；观察B组患者阴道菌群与对照组分布情况基本一致。通常情况下，女性阴道微生物中乳酸杆菌为主，其对保持女性阴道微生态平衡以及抑制病原微生物生长、增强女性阴道局部抗感染、抗肿瘤能力具有至关重要的意义。乳酸杆菌能够保护女性阴道黏膜上皮细胞不会受到病原菌的黏附，且还能够分泌出形成生物膜的物质，进而达到组织病原菌黏附以及侵袭的目的。观察B组与对照组均为以乳酸杆菌为主，存在256376，占比71．80%，加德纳菌属占比 12．91%，为 46091，剩余菌属为普雷奥、奇异以及斯尼斯菌等；观察A组中，乳酸杆菌属含量下降至220945，占比56．26%；加德纳菌属上升至76974．占19．60%，其奇艺异菌属含量上升为30240，占7．7%；本次研究中乳酸杆菌在观察A组患者中的标本中较少，说明乳酸杆菌数量下降会造成女性阴道微生态平衡受到破坏以及女性患者阴道微环境的变化，进而造成宫颈上皮对高危型人乳头瘤病毒的易感性增加，而观察B组乳酸杆菌含量与健康女性无差异说明宫颈上皮内瘤变Ⅱ/Ⅲ级患者病变与乳酸杆菌相关意义不大。本次研究中发现奇异菌属在观察两组中出现明显增多，既往有研究发现宫颈病变风险增加与患者宫颈菌群中奇异菌属上升具有一定关系，奇异菌在一定程度上能够刺激患者阴道上皮细胞的固有免疫，故奇异菌能够参与到宫颈病变的过程中。比较三组患者阴道菌群类型差异无统计学意义（P＞0．05）；根据本次研究菌落类型结果可知大多数患者检验结果提示为惰性乳酸杆菌以及卷曲乳酸杆菌，其中加氏乳酸杆菌为主的菌群类型较少。

综上所述，不同宫颈病变患者阴道菌群多样性以及类型与健康女性相似，但宫颈上皮内瘤变Ⅰ级患者阴道部分微生物菌类群丰度增加。