基于Oncomie和Kaplan-Meier Plotter数据库分析KLF5在胃癌中的表达及其与患者预后相关性

冯福梅, 张 磊

冯福梅, 张磊, 天津市宝坻区人民医院胃肠外科 天津市 301800

核心提要： 本文通过分析Oncomie和Kaplan-Meier Plotter数据库Kruppel样因子5(kruppel-like factor 5, KLF5)在胃癌(gastric cancer, GC)中的表达及其与患者预后相关性, 同时采用免疫组织化学方法证实KLF5在GC中高表达并与患者的不良预后有关, 提示KLF5可作为GC预后的潜在生物学分子标记物.

0 引言

胃癌(gastric cancer, GC)是临床上最为常见的消化道恶性肿瘤之一. 新近的流行病学数据显示, 2019年北美GC新确诊患者27510例, 而当年死亡人数为1140例, GC已成为癌症相关死亡的重要原因[1]. 我国GC患者整体预后较差, 主要原因为患者确诊时大多已发展为远处转移或区域淋巴结转移的进展期病变, 早期或超早期患者比例较少[2]. 近年来, 随着诊疗水平的提高和相关药物的研发, GC患者的整体预后有望得到改善. GC患者预后的影响因素较多, 包括临床分期、病理分级、术后辅助治疗等[3,4]. 同时已有研究发现, 部分肿瘤相关基因的表达水平与GC患者术后生存期存现相关性, 可作为GC患者预后或治疗反应率的生物学分子标志物[5,6]. 在本研究中, 我们探讨Kruppel样因子5(kruppel-like factor 5,KLF5)基因表达水平在GC组织中及正常胃粘膜中是否存在差异表达, 及其与患者临床病理特征和预后的关系.

1 材料和方法

1.1 材料 选取Oncomine (https://www.oncomine.org/)和Kaplan-Meier plotter (www.kmplot.com)数据库为KLF5基因表达数据挖掘研究对象, 对GC组织与正常组织KLF5基因表达芯片数据进行分析. 同时回顾性分析天津市宝坻区人民医院2016-01/2018-12收治并手术治疗的GC患者41例为临床标本研究对象进行KLF5蛋白表达水平与患者临床病理特征相关性分析.

1.2 方法

1.2.1 Oncomine数据分析: 在Oncomine数据库我们检索KLF5相关数据集, 限定条件为: (1)肿瘤类型: 胃肿瘤; (2)组织对比: 肿瘤组织vs正常组织; (3)数据类型:mRNA; (4)显著性:P＜1E-4; (5)差异表达级别: 大于2倍;(6)基因排序: 前10%.

1.2.2 Kaplan-Meier Plotter数据分析: 在Kaplan-Meier Plotter数据分析平台中, 我们检索KLF5基因, 并应用在线分析软件绘制KLF5高低表达的生存曲线. 限定条件为总生存和无疾病进展生存, 对肿瘤病理类型, 临床分期, 分级等不做限制.

1.2.3 免疫组化: 石蜡切片脱蜡水化, 蒸馏水浸泡冲洗后行抗原修复, PBS冲洗后滴加动物非免疫血清, 室温孵育10 min后倾去. 滴加一抗, 室温孵育60 min, 阴性对照用PBS代替. PBS冲洗后, 滴加生物素标记的二抗, 室温孵育10 min. PBS冲洗干净后滴加链霉菌抗生物素-过氧化物酶溶液, 室温孵育30 min. PBS冲洗, DAB显色剂显色, 中性树胶封片. 根据肿瘤细胞显色的比例及染色强度,KLF5表达做半定量判定. 按显色程度评分: 弱染色为1分; 中等染色为2分; 强染色为3分. 按阳性细胞率评分: 阳性细胞数占10%＜50%为2分; 50%＜80%为3分; ≥80%为4分. 无论染色强度如何, 细胞阳性率＜10%为阴性; (-); 评2分以上为阳性(+).

统计学处理数据分析采用SPSS 17.0软件完成, 定量数据应用mean±SD表示, 组间比较采用t检验; 定性数据采用率表示, 组间采用χ2检验; 生存分析绘制生存曲线并进行log-rank检验,P＜0.05为存在统计学差异.

2 结果

2.1KLF5在常见肿瘤中的表达 截止到2019-03, Oncomine数据库共收录了424个关于KLF5基因表达水平的相关研究, 其中在癌组织vs正常组织中差异表达的有35个,与正常组织相比, 8个数据集结果提示KLF5在癌组织中高表达, 27个数据集在癌组织中低表达(图1).

2.2KLF5在胃肿瘤中与其他基因共表达情况 我们应用Oncomine提供的在线分析功能, 对KLF5在GC中的共表达基因进行了聚类分析(图2). 结果显示,KLF5与ST14,TMEM125等20个基因存在共表达情况(在GC中共同低表达或高表达), 提示这些共表达基因在功能上可能存在相关性.

2.3KLF5在胃肿瘤的中表达 通过对Oncomine数据挖掘, 我们发现10个mRNA芯片数据集对比分析了GC组织与正常组织中KLF5基因的差异表达情况(图3). 10个基因芯片中, 有4个芯片数据提示了GC组织中KLF5表达水平明显升高.

2.4KLF5表达与患者预后 我们进一步对Kaplan-Meier Plotter数据库中,KLF5表达水平与GC患者预后的数据进行了挖掘, 并发现2个相关基因芯片数据, 分别为Affy ID: 209211_at和209212_s_at. 我们应用在线分析软件回执了KLF5高低表达的生存曲线(图4). 结果显示,KLF5高表达患者总生存和无疾病进展生存均小于低表达组(P＜0.05)(表1).

2.5 免疫组化检测KLF5蛋白表达及其与患者临床病理特征KLF5主要表达于细胞质, 呈棕褐色颗粒状均匀分布(图5). 41例GC患者中,KLF5阳性表达者29例, 阳性率为70.7(29/41).KLF5阳性表达与患者临床病理特征如性别、年龄、肿瘤分期、分级等无明显相关性(P＞0.05)(表2).

3 讨论

KLF5是真核生物中的基本转录元件结合蛋白2, 是一种锌指蛋白转录因子, 也被称为肠道富集Kruppel样因子(intestinal-enriched kruppel-Like factor, IKLF), 其通过激活或抑制目标基因的转录进一步调控基因表达的组织特异性和时间特异性, 同时在细胞的增殖、分化及细胞凋亡等过程中发挥着重要的作用[7-9]. 人KLF5染色体13q21区域,KLF5蛋白包含457个氨基酸, 分子量为55kDa, 其CDS编码区含有一个激活结构域和一个DNA结合结构域[7,10,11].KLF5含有许多靶基因, 如核因子kB,过氧化物酶增生物激活受体, 血小板源性生长因子a和T细胞抗原受体等, 在不同的细胞模型中这些基因都已被证实[12-14].KLF5作为一种锌指转录因子, 通过调节富含GC的启动子区域的表达, 进一步参与调节细胞增殖、细胞分化、细胞凋亡、个体发育等过程.

表1 KLF5表达与患者总生存及中为生存相关性

图1 KLF5在常见肿瘤中的表达情况分析.

已有研究显示, 与对应的正常组织相比,KLF5在多种肿瘤组织中呈现高表达, 如GC[15]、结直肠癌[16,17]、肺癌、乳腺癌等[18-20]. 但KLF5在肿瘤患者癌组织中的高表达是否与患者的预后及临床病理特征相关, 目前研究结果并不一致. 有研究认为,KLF5在肿瘤组织中的高表达往往与患者的预后不良有关, 高表达者中位生存时间及无疾病进展生存时间明显减低, 且KLF5的阳性表达往往与肿瘤的低分化及更高的临床分期有关[21]. 张小玲等[22]人采用采用免疫组化SP法检测79例GC组织和40例正常胃组织中KLF5的表达, 分析了KLF5表达与患者临床病例特征和预后的关系. 结果认为KLF5表达与GC分化程度、浸润和转移有关, 是GC不良预后的危险因素, 可作为GC预后评价的客观指标. 但亦有研究认为,KLF5表达水平与肿瘤患者的预后无关, 高低表达患者远期生存率无明显差异[23].

由于KLF5表达水平与GC患者预后及临床病理特征的关系并不明确, 我们采用Oncomie和Kaplan-Meier Plotter数据库中关于KLF5基因表达的相关数据进行深入挖掘, 探寻KLF5基因在GC组织与正常胃组织中的差异表达情况及其与患者预后的关系. 同时对41例GC患者的肿瘤组织切片进行免疫组织化学检测, 分析KLF5表达与患者临床病理特征的相关性. 在研究中我们发现, 与正常胃组织比较, GC组织中KLF5基因的mRNA表达水平明显上调, 且高表达与患者的预后不良有关. 而KLF5表达与患者的临床病理特征无相关性, 但由于纳入样本量较小, 这种弱的相关性可能并未被小样本实验所证实. 因此,KLF5高表达GC患者远期生存率低有关,提示其可作为GC患者术后复发、转移的等预后不良的生物学标志物. 也可能成为GC靶向治疗的及药物研发的分子靶点. 但本研究也存现一定的局限性, 免疫组织化学验证部分入组患者例数较少, 统计学效能较低, 且未进行随访评价KLF5表达与患者预后的关系. 因此, 下一步我们将继续扩大样本量, 延长随访时间, 明确KLF5高低表达与GC患者生存期的关系.

文章亮点

实验背景

胃癌(gastric cancer, GC)是较为常见的消化系统恶性肿瘤, 大多数患者就诊时已发展为晚期, 预后不良. 同时缺乏GC预后的分子标志物. Kruppel样因子5(kruppel-like factor 5,KLF5)在多种实体肿瘤中呈现差异表达, 并与患者的预后有关. 而KLF5在GC中的表达水平及其与GC患者的预后关系不清.

实验动机

探讨KLF5在GC中的表达及其与GC患者预后的关系,评价其作为GC预后分子标志物的可行性.

表2 KLF5蛋白表达及其与患者临床病理特征(n)

图2 KLF5基因共表达分析提示KLF5与ST14, TMEM125等20个基因存在共表达情况.

图3 KLF5在胃肿瘤的中表达基因芯片项数据集.

图4 KLF5表达与患者预后关系的生存曲线.

图5 KLF5在胃癌和正常胃黏膜中的表达情况.

实验目标

通过生物信息分析和组织标本验证, 揭示KLF5在GC中的差异表达情况, 并进一步明确其差异表达与患者生存期的关系.

实验方法

通过Oncomine数据库分析KLF5在GC中的差异表达; 通过Kaplan-Meier Plotter数据库分析KLF5高低表达与GC患者生存期的关系; 最后通过免疫组织化学方法进行证实.

实验结果

Oncomine数据库分析提示GC组织中KLF5表达水平明显升高. Kaplan-Meier Plotter数据分析显示KLF5高表达患者总生存和无疾病进展生存均小于低表达组(P＜0.05). 免疫组化分析显示KLF5阳性表达与患者临床病理特征如性别、年龄、肿瘤分期、分级等无明显相关性(P＞0.05).

实验结论

本研究发现KLF5在GC中高表达并与患者的不良预后有关, 而KLF5表达与患者临床病理特征无关. 本研究提出KLF5高表达患者总生存和无疾病进展生存期较低.检测KLF5在GC患者中的表达水平可作为GC预后的分子标志物. 为评估GC患者的生存期提供基础.

展望前景

KLF5在GC中的差异表达为其预后评价提供了可行性,并综合其他指标有望建立GC患者生存期预测模型, 为GC换的预后提供评价方法.