响应面优化北五味子米酒发酵工艺研究

刘 洋

（长春职业技术学院 食品与生物技术学院，吉林 长春 130033）

北五味子（Schisandra chinesis（Turcz.）Bsill.）产于吉林、辽宁、黑龙江、内蒙古等地，因其药用价值高，应用范围广，在国内外久负盛名。其果实粒大、肉厚、光泽好，有油性，药用成分高，疗效显著[1]。北五味子果实中含挥发油、柠檬酸、苹果酸、维生素C、维生素E、树脂、鞣质、多种氨基酸及少量糖类物质，还含有7种木脂素类化合物，如五味子酯甲、酯乙、醇甲、醇乙、甲素、乙素、丙素等[2-5]，研究表明这些成分多具有镇静[6]、镇痛[7]、镇咳[8]、延长睡眠时间[9]等药理作用，能降低血清谷丙转氨酶[10]、抗癌、抗艾滋病毒（human immunodeficiency virus，HIV）、拮抗血小板活化因子和抑制醛糖还原酶等多种活性，并且可以增强人体免疫力等功效等。临床上主要用于治疗失眠、焦虑、慢性肝炎、心脏病、肾虚久咳、降血脂、肺炎抗肿瘤等症[11-15]。

近年来采用传统生物发酵技术开发出五味子系列保健食品，包括五味子葡萄酒、啤酒、果醋、酸奶等，但在五味子米酒研究领域实属空白。北五味子果浆中富含单糖类、氨基酸、挥发油、有机酸、多种维生素等多种生理活性物质及K、Ca、Mg、Fe、Mn、Zn、Cu、Si等矿物质元素，能增强五味子发酵酒香气及口感；米酒酒香浓郁，香甜醇美，含有8种人体自身不能合成而又必需的氨基酸，其中赖氨酸的含量比葡萄酒要高出数倍，为世界其他营养酒类中所罕见，具有健脾养胃、补养气血、舒筋活血、祛风除湿的功效，是产妇和老年人的滋补佳品[16]。

吉林省是我国大米的主产区，年产量达到600多万t，约占东北大米总产量的24%，而且大米的感官品质极佳，晶莹剔透、香甜软糯，大米中淀粉含量占75%左右，淀粉作为多糖是酿酒的主要原料，在适宜的发酵条件下可以分解产生糊精、葡萄糖、麦芽糖等低聚糖，不但可用于酒曲中微生物生长繁殖，还可被霉菌、酵母菌利用产生酒精。延边大学的张玲[17]选用大米为主要原料制备米酒，详细阐述了制作工艺及操作要点。鉴于应用大米制作米酒存在先例并具有可行性，因此，本研究以吉林省农产品大米为主要原料酿造五味子米酒，并通过其发酵工艺优化，将五味子功能特性及营养成分引入米酒制作中，形成酸甜可口的特殊风味，改善传统米酒的口感，提高传统米酒的营养价值及保健功效，为打造新一代高端功能性饮品提供新的参考。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

北五味子（Schisandra chinesis（Turcz.）Bsill.）：吉林省蛟河市；大米：吉林省永吉县；甜酒曲：安琪酵母股份有限公司；硫酸铜、亚铁氰化钾、酒石酸钾钠、葡萄糖（均为分析纯）：国药集团化学试剂有限公司。

1.2 仪器与设备

LB50T手持糖度计：深圳市德优平科技有限公司；SPM-808智能生化培养箱：宁波江南仪器厂；HH-8型恒温水浴锅：常州迅生仪器有限公司；Alcomat Super酒精度测试仪：北京三思智业科技有限公司；FA系列电子分析天平：上海越平科技有限公司。

1.3 方法

1.3.1 北五味子米酒发酵工艺流程及操作要点

北五味子果浆制备：9月上旬，选择果粒饱满的北五味子鲜果，用清水浸泡洗除表皮污物，加入0.05%的高锰酸钾消毒，按照料液比1∶1加入水于北五味子果中，经高速剪切乳化机1 000 r/min进行打浆处理5 min，过滤渣料，测果浆可溶性固形物含量105℃灭菌15 min后以备用接种[18-19]。

浸米：原料大米净水洗净，加入清水浸没，米和水的比例为1.0∶2.0（g∶mL），将大米放在30 ℃的恒温生化培养箱中，浸米24 h，浸泡达到米粒外观由透明变白色，手捏即碎为宜[20]。

拌曲添浆：将浸泡好的大米用蒸锅蒸煮约45 min，蒸好的大米用约20℃的凉水淋至室温，沥干水分后进行落缸，加入一定量的甜酒曲，搅拌均匀；加入一定量的北五味子果浆，搅拌均匀；在米饭中央位置挖出一个倒喇叭状的窝，以增加米饭与空气的接触面积，释放热量，便于观察产酒情况[21]。

糖化发酵：前期糖化温度36℃，糖化时间36～84 h；糖化结束后，将糖化醪放于20℃条件下保温发酵24～60 h。

杀菌保藏：将米酒用发酵罐密封加热至75℃左右杀菌15～20min，保温30s后冷却，冷却后即制得北五味子米酒。

1.3.2 单因素试验

选取北五味子果浆添加量（8%、12%、16%、20%、24%）、酒曲接种量（1.0%、1.5%、2.0%、2.5%、3.0%）、糖化时间（36h、48 h、60 h、72 h、84 h）、发酵时间（32 h、40 h、48 h、56 h、64 h）4个因素进行单因素试验，糖化温度为36℃、后发酵温度为20℃，分别考察各因素对米酒理化指标及感官评分的影响。

1.3.3 北五味子米酒发酵工艺的响应面优化设计

以北五味子果浆添加量（A）、酒曲接种量（B）、糖化时间（C）、发酵时间（D）为考察因素，以感官评分为评价指标，利用Design Expert 8.0软件进行Box-Behnken中心组合试验设计，试验因素与水平如表1所示[22]。

表1 北五味子米酒发酵工艺条件优化响应面试验因素与水平Table 1 Factors and levels of response surface experiments for fermentation process optimization ofSchisandra chinesis rice wine

1.3.4 测定方法

（1）理化指标测定

斐林试剂法测定还原糖（以葡萄糖计）[23]；酒精计法测定酒精度[23]；电位滴定法测定总酸[24]。

（2）感官评价方法

选择15名感官评定专业人员组成评定小组，参照NY/T 1885—2017《绿色食品米酒》对北五味子米酒从色泽（25分）、香气（35分）、口感（40分）3个方面进行评价，满分为100分，具体评价标准见表2[25]。

表2 北五味子米酒感官评价标准Table 2 Sensory evaluation standards ofSchisandra chinesis rice wine

2 结果与分析

2.1 单因素试验

2.1.1 北五味子果浆添加量对米酒理化指标及感官评分的影响

参照上述北五味子米酒发酵工艺，设计北五味子果浆添加量分别为8%、12%、16%、20%、24%，设置甜酒曲接种量2%、糖化时间48 h、发酵时间48 h，考察北五味子果浆添加量对五味子米酒品质的影响，结果见图1。

图1 北五味子果浆添加量对米酒理化指标及感官评分的影响Fig.1 Effect ofSchisandra chinesisfruit pulp addition on physicochemical indexes and sensory evaluation score of rice wine

由图1可知，当北五味子果浆添加量在8%～16%范围内时，随着北五味子果浆添加量的增加，米酒中酒精度、还原糖、总酸含量均呈现上升的趋势，其中酒精度从2.51%vol增加至6.14%vol；还原糖从10.58g/100g增加至24.78g/100g；总酸含量从0.37 g/100 g增加至0.80 g/100 g；当北五味子果浆添加量在8%～16%范围内时，北五味子米酒感官评分随着五味子果浆添加量的增加而增加，感官评分最高可达91.1分，此时米酒中还原糖含量为16.81 g/100 g，酒精度为4.45%vol，总酸为0.65 g/100 g；北五味子果浆添加量在16%～24%范围内时，北五味子米酒感官评分呈现降低的趋势；当北五味子果浆添加量为24%时，北五味子米酒感官评分降至70.2分。北五味子果浆本身具有独特的酸甜滋味，稍有咸味，与大米一起发酵，通过缓解高渗透压对菌种的抑制而提高发酵速度，增强米酒的香气，但北五味子果浆添加量过大，增加了甜酒曲的含水量，导致酵母发酵速度变慢，产酒量减少，米酒风味下降，酒体呈现微浑。因此，北五味子果浆最适添加量为16%。

2.1.2 甜酒曲接种量对米酒理化指标及感官评分的影响

设置北五味子果浆添加量为16%，甜酒曲接种量分别为1.0%、1.5%、2.0%、2.5%、3.0%，设置糖化时间48 h、发酵时间48 h，考察甜酒曲接种量对北五味子米酒品质的影响，结果见图2。

图2 甜酒曲接种量对米酒理化指标及感官评分的影响Fig.2 Effect of sweetJiuquinoculum on physicochemical indexes and sensory evaluation score of rice wine

由图2可知，随着甜酒曲接种量的增加，北五味子米酒发酵液中酒精度与总酸含量逐渐升高，还原糖含量先增高后下降。当甜酒曲接种量在1%～2%范围内时，还原糖含量从14.43 g/100 g增加至29.87 g/100 g，甜酒曲接种量超过2.0%时，还原糖含量逐渐下降，接种量达3%时，最低还原糖含量达10.23 g/100 g，这是因为菌种发酵使糖转化为酒精；所以酒精度保持升高趋势，酒精度含量过高米酒口感下降，因此当甜酒曲接种量为2.5%时，米酒中还原糖含量为18.52 g/100 g，酒精度为5.80%vol，总酸含量为0.75 g/100 g，此时米酒的感官评分达最高为86.4分，甜酒曲接种量达3.0%时，米酒口感下降，有明显的酸涩感，由于甜酒曲接种量增加，发酵体系急剧升温，酵母菌大量繁殖，引起酸败现象，影响米酒澄清度，感官评分降低到73.2分。因此，最适宜甜酒曲接种量为2.5%。

2.1.3 糖化时间对米酒理化指标及感官评分的影响

北五味子果浆添加量为16%，甜酒曲接种量为2.5%，设置糖化时间分别为36 h、48 h、60 h、72 h、84 h，发酵时间48 h不变，考察糖化时间对北五味子米酒品质的影响，结果见图3。

图3 糖化时间对米酒理化指标及感官评分的影响Fig.3 Effect of saccharification time on physicochemical indexes and sensory evaluation score of rice wine

由图3可知，随着糖化时间的延长，北五味子米酒中酒精度、还原糖及总酸含量都随之升高，在糖化时间达48 h时，酒精度达6.78%vol，还原糖含量达23.35 g/100 g，总酸含量为0.18 g/100 g，此时米酒清澈，口感较好，感官评分最高达88.7分；在糖化时间48～84 h内，酒精生成量上升比较明显，最高酒精度达9.74%vol，由于糖化过度使得米粒出现碎裂现象，酒味也变得更加浓烈，米酒品质下降，酒体浑浊，米酒感官评分下降。因此，最适宜糖化时间为48 h，此时米酒口感醇厚，风味纯正，酒体协调，澄清度较好。

2.1.4 发酵时间对米酒理化指标及感官评分的影响

北五味子果浆添加量为16%，甜酒曲接种量为2.5%，糖化时间48h，设计发酵时间分别为32h、40h、48h、56h、64h，考察发酵时间对北五味子米酒品质的影响，结果见图4。

图4 发酵时间对米酒理化指标及感官评分的影响Fig.4 Effect of fermentation time on physicochemical indexes and sensory evaluation score of rice wine

由图4可知，随着发酵时间延长，米酒中还原糖呈现先升高后降低的趋势，酒精度及总酸含量逐渐升高，发酵时间短，发酵液中根霉糖化不完全，米酒中还原糖及酒精度均较低，风味不显著；延长发酵时间使淀粉被淀粉酶充分分解，发酵液总糖含量升高，在发酵时间达48 h时，还原糖含量达最高为19.90 g/100 g，酒精度为6.19%vol，总酸含量为0.34 g/100 g，此时酒体清澈、淡淡的酒香味，口感舒爽，感官评分较高达91.2分。发酵时间超过48 h，酵母发酵载体的底物浓度增大，使酵母对糖的利用度加速，总糖含量明显下降，整个发酵体系代谢过程变缓，菌种衰减，米酒味道酸涩，口感下降，因此，最适宜发酵时间为48 h。

2.2 响应面试验

通过响应面法对北五味子果浆添加量（A）、甜酒曲接种量（B）、糖化时间（C）、发酵时间（D）4个因素分析，设置3个水平对试验条件进行优化，响应面试验结果与分析见表3，方差分析见表4。

表3 北五味子米酒酿造工艺条件优化响应面试验设计及结果Table 3 Design and results of response surface experiments for fermentation process conditions optimization of Schisandra chinesisrice wine

通过DesignExpert8.0软件对表3的数据进行分析，得到4个因素的多元回归方程：Y=+84.28+8.27A+8.18B+10.21C+1.51D+0.88AB-2.83AC+2.65AD+0.98BC+6.25BD+4.47CD-5.17A2-6.42B2-8.44C2-6.86D2。

表4 回归模型方差分析Table 4 Variance analysis of regression model

续表

方差来源 平方和 自由度 均方 F值 P值 显著性AD BC BD CD A2 B2 C2 D2 0.84 0.11 4.67 2.39 5.19 8.00 13.79 9.12 0.375 1 0.741 1 0.048 5 0.144 2 0.039 0 0.013 4 0.002 3 0.009 2不显著不显著显著不显著显著显著极显著极显著残差失拟项纯误差总离差28.09 3.80 156.25 80.10 173.60 267.63 461.60 305.33 486.60 372.95 95.65 4 465.05 1 1 1 1 1 1 1 1 1 4 10 4 28 28.09 3.80 156.25 80.10 173.60 267.63 461.60 305.33 33.47 37.30 23.91 1.560.354 8不显著

根据表4方差分析结果可知，北五味子米酒感官评分的回归方程与响应面试验结果的关系模型显著（P＜0.05），并且失拟项不显著（P＞0.05），表明该试验模型充分拟合试验数据，即可以利用此感官评分的回归方程确定北五味子米酒发酵的最佳工艺。

多元回归方程一次项D和交互项AB、AC、AD、BC、CD对北五味子米酒感官评分没有显著性影响（P＞0.05），交互项BD、A2、B2对北五味子米酒感官评分表现出显著的影响（P＜0.05），其中一次项A、B、C与二次项C2、D2对北五味子米酒感官评分影响为极显著（P＜0.01），这表明四个试验因素对五味子米酒响应值感官评分的影响不是单纯的线性关系，而是表现为二次关系。

各因素对北五味子米酒感官品质的响应面结果见图5。由图5可知，甜酒曲接种量与发酵时间之间的交互作用对感官评分影响显著（P＜0.05），与表4方差分析结果相吻合。随着甜酒曲接种量的逐渐增加，造成发酵液酒精体积分数偏高，随着发酵时间的延长，发酵液酒精中糖分不断转换成乙醇和香气物质，导致感官评分分数偏高。北五味子果浆添加量、甜酒曲接种量、糖化时间三者对北五味子米酒感官评分的影响均较大，按主次顺序排列为糖化时间＞北五味子果浆添加量＞甜酒曲接种量＞发酵时间；与表4方差分析结果相吻合。

图5 北五味子果浆添加量、甜酒曲接种量、糖化时间、发酵时间交互作用对五味子米酒感官评分影响的响应面及等高线Fig.5 Response surface plots and contour line of effects of interaction betweenSchisandra chinesisfruit pulp addition,sweetJiuquinoculum,saccharification time and fermentation time on the sensory evaluation score ofSchisandra chinesisrice wine

2.3 优化条件的确定和模型验证

通过软件分析确定北五味子米酒最佳发酵工艺为北五味子果浆添加量为16.28%、甜酒曲接种量为2.15%、糖化时间为48.86 h、发酵时间47.64 h，北五味子米酒感官评分预测值为92.43分。为方便实际操作，根据3组验证试验对试验数据进行适当调整，调整后北五味子果浆添加量16.3%、甜酒曲接种量为2.2%，糖化时间48.9 h，发酵时间47.6 h；采用此条件进行验证试验，得到北五味子米酒的感官评分为93.3分，实测值与预测值相对误差为0.9%，表明该预测结果与真实试验情况较符合，具有一定的参考价值。

2.4 响应面优化五味子米酒理化及微生物指标检测结果

在北五味子米酒最佳发酵工艺条件下测定还原糖含量为11.94 g/100 g；酒精度为6.75%vol；总酸为0.86 g/100 g。北五味子米酒中微生物菌落总数34 CFU/g；大肠菌群1.87 MPN/100 g，未检出其他致病菌。理化及微生物指标检测结果符合NY/T 1885—2017《绿色食品米酒》要求[26]。

3 结论

在单因素试验的基础上用响应面分析法对五味子米酒的发酵工艺条件进行了优化，影响北五味子米酒感官评分的工艺因素按主次顺序排列为糖化时间＞北五味子果浆添加量＞甜酒曲接种量＞发酵时间。最终确定北五味子米酒最佳发酵工艺参数为北五味子果浆添加量16.3%、甜酒曲接种量为2.2%、糖化时间48.9 h、发酵时间47.6 h，采用此工艺酿造的北五味子米酒感官评分为93.3分。北五味子米酒汤色呈现棕褐色，清澈透明，有典型的米酒发酵香，酒味醇厚，入口甜美，营养丰富。米酒理化及微生物指标满足相关标准要求。