地衣多糖酶的研究进展

殷程程，杨述祯，岳慧娟，杨丰科*

（青岛科技大学 化工学院，山东 青岛 266042）

β-1,3-1,4-葡聚糖是谷物细胞壁和胚乳中的多糖成分，占谷物干质量的5.5%以上[1]，但是因为其溶解在水中具有很高的黏度[2]，使得谷物的利用率低，所以是抗营养因子。地衣多糖酶能够特异性水解地衣多糖和β-1,3-1,4-葡聚糖[3]，从而降低谷物溶液的黏度，增加β-葡聚糖的消化率进而改善其转化效率。地衣多糖酶可以很好的与洗衣粉、洗衣液兼容[4]，用于去除含有β-葡聚糖的食品和产品污渍；在欧洲，常使用地衣多糖酶分解大麦淀粉来生产燃料乙醇[5]。但是地衣多糖酶受到价格和质量的影响，目前市场上的地衣多糖酶不能满足工业的要求。因此如何开发酶活力高和性质更好的地衣多糖酶仍是酿造、医药和饲料制造等企业的研究重点。国内外的许多学者对地衣多糖酶进行了研究，本文对地衣多糖酶的来源、性质、应用以及酶活力测定方法进行了综述，为地衣多糖酶的进一步研究提供了参考。

1 地衣多糖酶的来源

地衣多糖酶主要来源于微生物和植物[6-8]，其中细菌中的地衣多糖酶被报道的最广泛、研究的最透彻。早期对产地衣多糖酶的研究集中在产酶菌种的筛选、产酶的条件优化以及地衣多糖酶的酶学性质等。随着更加深入的研究，发现来自天然的地衣多糖酶很难同时满足工业生产中的温度、pH和酶活力的要求。因此，近些年来地衣多糖酶的基因克隆和外源表达等不断地被研究。随着研究的不断深入，人工改造地衣多糖酶将会受到广泛关注。

产地衣多糖酶的细菌主要是芽孢杆菌，包括地衣芽孢杆菌（Bacillus licheniformis）[9]、短小芽孢杆菌（Bacillus pumilus）[10]、枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis）[11]、解淀粉芽孢杆菌（Bacillus amyloliquefaciens）[12]、多黏类芽孢杆菌（Paenibacillus polymyxa）[13]、巴伦氏类芽孢杆菌（Paenibacillusbarengoltzii）[14]等。此外，还有一些细菌，如甲基营养型芽孢杆菌（Bacillus methylotrophicus）[15]和热纤梭菌（Clostridiumthermocellum）[16-17]等也产地衣多糖酶。除了细菌之外，真菌也是地衣多糖酶的重要来源之一，如好氧真菌埃默森篮状菌（Talaromyces emersonii）[18-19]、黑曲霉（Aspergillus niger）[20]、青霉属（Penicillium）[21]、拟青霉（Paecilomyces）[22-23]和嗜热子囊菌（Thermoascus aurantiacus）[24]等，其中，来自橙色嗜热子囊菌的地衣多糖酶的酶活力为3 741 U/mL，而且分别在pH 6.0和75℃条件下具有最高的活性。

2 地衣多糖酶的酶学性质

地衣多糖酶的来源广泛，不同来源的地衣多糖酶有不同的性质。这种差异不仅表现在物种间，也表现在种属间。大多数的地衣多糖酶都是胞外酶，常采用离心、超滤、沉淀、层析等方法进行分离纯化。

真菌中的地衣多糖酶的最适pH一般为4.8～6.0，最适温度为75～80℃，普遍具有耐酸、耐高温的特点。真菌来源的地衣多糖酶的分子质量大多在30kDa～45kDa；其米氏常数（Km）也差异较大，一般为0.62～13.38 mg/mL，这表明真菌来源的不同地衣多糖酶与底物的亲和性差异较大。目前有关真菌来源的地衣多糖酶的报道较少。MURRAY P G等[18]在2000年以麦麸和甜菜浆为碳源，从好氧真菌埃默森篮状菌CBS 814.70中发酵得到地衣多糖酶，该酶是单一亚基糖蛋白，其分子质量和等电点值分别为（40.7±0.3）kDa和pH 4.4，在较宽的pH值和温度范围内显示出活性，其最佳pH值为4.8，最适温度为80℃。该酶具有显着的热稳定性，在100℃温育15 min后剩余15%的原始活性；以地衣多糖和β-葡聚糖为底物时，该酶具有相同的米氏常数（Km）为13.38 mg/mL，而用地衣多糖的最大反应速率（Vmax）约为142.9 IU/mg，是用β-葡聚糖（79.3 IU/mg）获得的值的2倍。ELGHARBI F等[20]以大麦粉为碳源，在黑曲霉US368中发酵得到新型的热稳定性的地衣多糖酶，该酶的分子质量为32 kDa，对葡聚糖的米氏常数（Km）为0.62 mg/mL，对地衣多糖的米氏常数（Km）为0.38 mg/mL。该酶的最适pH为5.0，最适温度为60℃，具有显著的热稳定性，在70℃时半衰期为30 min；在37℃条件下，该酶在pH 3～10条件下表现出100%的稳定性。YAN Q等[24]以玉米芯为碳源，从嗜热子囊菌CAU830中发酵得到地衣多糖酶，该酶的最高酶活力为3 741 U/mL，分子质量约为34 kDa，在pH6.0和75℃条件下分别具有最适活性，而且其表现出优异的热稳定性，在50℃、60℃和70℃时热变性半衰期分别为209min、130min、69min。该酶对大麦β-葡聚糖（13527U/mg）、燕麦β-葡聚糖（12 502 U/mg）和地衣多糖（9 225 U/mg）表现出严格的底物特异性，但对其他测试的多糖（包括昆布多糖、木聚糖、支链淀粉）没有表现出活性。

细菌来源的地衣多糖酶的分子质量为25～75 kDa，最适温度和最适pH值分别为50～70℃和5.0～7.0，米氏常数（Km）在1.82～8.00 mg/mL。ELGHARBI F等[10]从受污染的大麦样品中分离出短小芽孢杆菌US570菌株，该菌株产生的地衣多糖酶的分子质量大小为75 kDa，该酶在广泛的pH和温度范围内具有活性，并有良好的热稳定性。在pH 3～9的范围内显示出显著的活性（超过50%的酶活性），在pH 6时具有最大活性；在温度40～65℃之间酶活性超过80%，最适酶活温度为55℃，而且在80℃条件下半衰期为30min。该酶是细菌地衣多糖酶中最先报道有三聚体结构的酶。FURTADOGP等[11]将枯草芽孢杆菌中的地衣多糖酶基因进行重组并在大肠杆菌中进行表达，产生的地衣多糖酶的最适温度为50℃，最适pH为6.0，分子质量为28 kDa，米氏常数（Km）为（3.1±0.37）mg/mL。GAO Z[9]从花园土壤里分离出地衣芽孢杆菌并在该菌中纯化出地衣多糖酶，该酶的分子质量为25 kDa，最适pH和温度分别为6.5和60℃。米氏常数（Km）对于地衣多糖为5.11 mg/mL，对大麦β-葡聚糖为7.42 mg/mL，纯化后酶的活性远高于大多数报道的β-1,3-1,4-葡聚糖酶的活性。

来自于细菌的地衣多糖酶的热稳定性普遍低于来源于真菌的地衣多糖酶，最适pH大多以中性为主，但是由于细菌来源的地衣多糖酶的种类多、表达量多、生产条件较成熟，目前广泛应用于工业生产。而且随着基因工程的发展，研究出越来越多高效表达地衣多糖酶的方法，这拓宽了地衣多糖酶的来源，同时降低了生产成本。

表1 不同来源的地衣多糖酶的性质Table 1 Properties of lichenase from different origins

3 地衣多糖酶的应用

3.1 食品和饲料添加剂

许多化工合成的抗微生物和抗氧化的防腐剂被添加到食品中用于控制微生物生长并延长食品的保质期。然而这些化学物质会影响健康，经常食用含有化学防腐剂的食品会产生一些不利于身体健康的作用，如抗生素耐药性和癌症。因此提高消费者对更多天然食品或食品添加剂的认识，建议将具有益生菌特性的菌种作为天然防腐添加剂代替化学防腐添加剂。抗生素和抗菌生物补充剂如益生菌可以增加食物的保质期，提高营养价值，并且由于这些生物防腐剂具有治疗效果，有利于消费者健康。益生菌长期以来一直用于食品加工，特别是用于牛奶、乳制品以及医药、农业和水产养殖业的天然食品添加剂。GUNYAKTI A等[28]研究了源自人母乳的加氏乳杆菌作为食品添加剂的潜在用途，证实了该菌不仅会抑制微生物的生长，而且其产生的地衣多糖酶可以帮助人体消化吸收营养物质。由于猪和其他禽类无法自发产生地衣多糖酶，当以大麦、燕麦等为饲料的主原料时，β-1,3-1,4-葡聚糖会作为抗营养因子影响它们对营养物质的吸收。在饲料中添加地衣多糖酶，可以降低谷物在动物体内的黏度，有助于小肠吸收饲料中的营养物质，提高饲料的转化率。在饲料生产加工过程中，热处理是必不可少的，因此具有热稳定性的地衣多糖酶对于饲料加工行业来说有着非常重要的作用。

3.2 酿酒行业

在酿酒行业中，酒的澄清度、色度、香气、口味和原麦汁浓度是鉴定酒质量好坏的标准。谷类是酿酒的主要原料之一，在酿造过程中对谷物的发酵处理决定着产品的质量。β-1,3-1,4-葡聚糖普遍存在于谷物胚乳和细胞壁中，在酿造过程中，内源性地衣多糖酶会部分水解这些β-1,3-1,4-葡聚糖。然而在糖化过程中，糖化温度升至76～78℃会使地衣多糖酶失活，剩余的未水解的高分子质量β-1,3-1,4-葡聚糖与水结合，使得麦芽液的黏度增大、过滤困难、形成明胶悬浮液，同时也使得麦芽的浸出率降低，这样会降低酒的质量也增加了生产成本。GOLDENKOVA-PAVLOVAIV等[38]将B.terquilensisCGX 5-2的地衣多糖酶进行定点突变产生了酶的突变体，发现该酶的最佳温度提高至70℃，并且与初始地衣多糖酶相比，该酶在酸性条件下的稳定性超出了天然酶的370%和800%，而且催化活性增加了63%。在麦芽液中添加该改良过的地衣多糖酶，发现过滤时间和滤液黏度分别降低了21.3%和9.6%。NIU C等[39]用野生型地衣多糖酶、改良后的地衣多糖酶，发现添加野生型的酶、改良后的酶和商业酶分别将麦芽浆的过滤时间减少了8.4%、21.3%和16.8%同时将滤液黏度降低了3.5%、9.6%和7.9%。这表明改良后的酶在糖化中降解β-葡聚糖的性能优于野生型和商业酶。CHAARI F等[29]研究了来自青霉Pol6菌株的地衣多糖酶，研究发现用来自青霉的地衣多糖酶处理麦芽液一段时间后，麦芽液的黏度和过滤时间与目前在酿造工业中使用的商业葡聚糖酶（Finizym）相比分别减少了1.82%、3.7%。NIU C等[30]将枯草芽孢杆菌中地衣多糖酶的基因提取、重组、导入到大肠杆菌中表达，产生的地衣多糖酶可以减少麦芽液的过滤时间和黏度。麦芽液的过滤时间和黏度分别从（202±3）s和（1.14±0.01）mPa·s减少至（142±2）s和（1.00±0.01）mPa/s，这比商业酶II（（168±2）s和（1.05±0.01）mPa·s）和商业酶Ⅰ（（146±1）s和（1.02±0.01）mPa·s）的效果更好。在酿造过程中添加地衣多糖酶不仅可以解决产品黏度大、沉淀多的问题，也降低了生产成本。因此地衣多糖酶分解β-1,3-1,4-葡聚糖的能力，使得它在酿造行业有着巨大的潜力。

3.3 地衣多糖酶的其他应用

地衣多糖酶除了应用在饲料和酿造行业之外，其可以降解β-1,3-1,4-葡聚糖和地衣多糖酶的特性也可以应用于洗涤剂、工业燃料等方面。CHAARI F等[4]已经研究证明，地衣多糖酶在以漂白剂为主要成分的洗涤剂中表现出显著的稳定性。继续研究了地衣多糖酶与洗涤剂的兼容性，发现地衣多糖酶与一些商业液体洗涤剂能够相容且有一定的稳定性。地衣多糖酶在液体洗涤剂Dinol和Ariel的存在下分别保留了约92%和80%的初始活动，但是其在SIC-linge洗涤剂存在下不太稳定，保留了62%的活性。此外，其在一些商业固体洗涤剂中显示出优异的稳定性和相容性，如在OMO、Nadhif和Fino洗涤剂中分别保留了其初始活性的约98%、97%和93%。然而，在Dixan洗涤剂的存在下，地衣多糖酶不太稳定，仅有69%的初始活性。YANG S等[37]在嗜热真菌中发现了新型的碱性地衣多糖酶，这也是最先报道的碱性地衣多糖酶，纯化的酶在pH 10.0和55℃条件下具有最适活性，并且在较宽的pH（pH 4.0～10.0）范围内稳定。该酶在常用洗涤剂的主要成分（包括Tween80、Triton×100、次氯酸钠和H2O2）存在时表现出优异的稳定性，保留了其原始活性的90%以上。该酶在一些商业液体和固体洗涤剂，如OMO（洗涤液）、蓝月亮（洗涤液）、Fresh'nHygiene（洗涤液）、OMO（洗衣粉）、雕牌（洗衣粉）、汰渍（洗衣粉）和Super（天然皂粉）存在下分别保留了101%、97%、103%、106%、100%、90%和93%的酶活性。此外，该酶还在各种非离子表面活性剂和氧化剂中稳定，因此，碱性地衣多糖酶可能有应用于多种工业的潜力，如洗涤剂、纸张和纸浆工业。DIVATE R等[5]研究了地衣多糖酶在生物燃料生产中的作用。实验结果证明地衣多糖酶和β-葡萄糖苷酶在水解β-葡聚糖中有协同作用，提高糖化和发酵效率；耐热酵母能够在40℃条件下的分步水解发酵（separate hydrolysis andfermentation，SHF）模型中有效地将β-葡聚糖的酶促水解产物发酵成乙醇；固定化酵母能以100%发酵效率重复使用9个循环。这表明在地衣多糖酶的作用下，大麦中的β-葡聚糖可以很好的转化为燃料乙醇，这大大降低了乙醇的生产成本。

4 地衣多糖酶的测定方法

目前，市场上的地衣多糖酶多而杂，酶质量也是良莠不齐。区分酶质量好坏的一个重要指标之一就是酶活力的大小，因此，一个灵敏度高、重复性好的酶活力检测方法对酶工业的生产起着非常重要的作用[26]。MANGAN D等[27]旨在研究出可自动化测定地衣多糖酶活力的比色测定法这一新的测定酶活的新方法，首先研究了基于直接切割或酶偶联底物的两种测定形式，发现“直接裂解”底物，即4,6-O-亚苄基-2-氯-4-硝基苯基-β-31-纤维三糖基-β-吡喃葡萄糖苷这一底物是最经常使用的。比色测定法的一个关键是寡糖和发色团的性质，另一个关键点在于通过改变发色基团的离去能力，从而调节底物的灵敏度。他们筛选出在一定的pKa条件（底物不发生自身水解且容易酶促切割）下易断裂的发色团，通过在底物上连接上这一发色团形成新的底物MBG4。测定方法即将酶与MBG4底物混合，反应一段时间后在波长400 nm处测定吸光度值。

5 结语与展望

地衣多糖酶作为一种添加剂，有着显著的经济和社会效益，也拥有着广阔的开发前景。目前，国内外也在不断优化产地衣多糖酶的菌种的发酵条件[31-32]，以期满足工业生产的需求。但是目前的地衣多糖酶仍有一些不足，如热稳定性差、不耐酸耐碱、酶活力低等，不能满足工业的需求。随着基因工程和蛋白质工程的发展，许多研究者根据地衣多糖酶的结构信息对地衣多糖酶进行结构改造[33-34]、对地衣多糖酶的某个关键氨基酸进行定点突变[35-36]或将某种微生物的地衣多糖酶的基因进行外源表达[30]等，研究出了比市场上的酶更耐酸和耐高温的酶。但是，这仍不能满足工业上对地衣多糖酶的需求，因此新型地衣多糖酶的开发仍需研究。此外，目前国内外所使用的酶活力测定方法多为人工手动测定，会产生许多使得实验数据误差变大的因素，而且对实验操作者的要求很高。因此一种自动化测定酶活力的方法还有待研究。