PEDV、TGEV、PDCoV、PRoV多重TaqMan荧光定量RT-PCR检测方法的建立及应用

施开创，王睿敏，黎宗强*，谢守玉，尹彦文，陆文俊，屈素洁

(1.广西动物疫病预防控制中心，广西南宁530001；2.广西大学动物科学技术学院，广西南宁530005)

传染性腹泻是仔猪的常见疾病，该病是导致仔猪死亡的主要原因之一，给养猪业造成极大的经济损失[1-2]。其中，猪流行性腹泻病毒(Porcine epidemic diarrhea virus，PEDV)、猪传染性胃肠炎病毒(Porcine transmissible gastroenteritis virus，TGEV)、 猪 德 尔 塔冠状病毒(Porcine deltacoronavirus，PDCoV)、猪轮状病毒(Porcine rotavirus，PRoV)是主要病原[2-4]。这4种病毒均可以导致高度传染性的肠道疾病，以厌食、呕吐、腹泻和脱水为主要特征，临床症状和病理剖检变化极为相似，难以区分，加上多种病原的混合感染、继发感染非常普遍[5-6]，给临床及时、准确诊断带来很大困难。因此，本研究针对PEDV、TGEV、PDCoV、PRoV设计特异性引物和探针，优化反应条件，建立了同时检测并区分这4种病毒的多重荧光定量RT-PCR方法，为这4种疾病的检测提供了有效的技术手段。

1 材料与方法

1.1 病毒株和临床病料样品 PEDV疫苗株(CV777株)、TGEV疫苗株(H株)、PDCoV分离株(GX1701株)、PRoV疫苗株(NX株)、猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)疫苗株(TJM-F92株)、猪伪狂犬病病毒(PRV)疫苗株(Bartha-K61株)、猪口蹄疫病毒(FMDV)O型疫苗株(O/Mya98/XJ/2010株)、猪细小病毒(PPV)疫苗株(N株)、猪瘟病毒(CSFV)疫苗株(C株)、猪圆环病毒2型(PCV2)疫苗株(SX07株)均由本实验室保存。

243份临床腹泻样品，包括腹泻仔猪的粪便拭子、病猪和死亡仔猪的小肠及内容物，于2018年采集自广西各地发生腹泻的猪场。

1.2 主要试剂 Mini Plasmid Kit、E.coliDH5α感受态细胞均购自天根生化科技(北京)有限公司；PrimeScriptTMⅡ 1ststrand cDNA SynthesisKit、MiniBEST Agarose Gel DNA Extraction Kit Ver.4.0、MiniBEST Viral RNA/DNA Extraction Kit Ver.5.0、EcoRⅠ、HindⅢ、pMD18-T载体、Premix ExTaqTM(Probe qPCR)均购自宝生物工程(大连)有限公司。

1.3 引物和TaqMan探针的设计 根据GenBank中登录的PEDV(AF353511)、TGEV(DQ811789)、PDCoV(JQ065042)、PRoV(FJ617209)参考株基因序列，分别设计4对特异性引物及相应的TaqMan荧光探针(表1)，用于扩增PEDV N基因、TGEV M基因、PDCoV M基因、PRoV VP6基因。引物和探针均由宝生物工程(大连)有限公司合成。

表1 扩增PEDV、TGEV、PDCoV、PRoV的引物及探针序列

1.4 临床样品的处理及基因组的提取 粪便拭子加入含1 mL pH7.2 PBS液的灭菌离心管内，反复振荡1 min，5 000 r/min离心10 min，取上清；剪取小肠组织，加入含适量(W/V，1:4)pH7.2 PBS液的灭菌离心管中捣碎后反复冻融3次，5 000 r/min离心10 min，取上清。按照RNA/DNA抽提试剂盒说明书抽提样品上清中总RNA后，反转录为cDNA，-20℃保存备用。

1.5 重组质粒标准品的制备 取PEDV CV777株、TGEV H株、PDCoV GX1701株、PRoV NX株病毒液抽提总RNA并反转录为cDNA，分别以其为模板，应用设计的4对引物分别进行PCR扩增。回收、纯化PCR产物，分别连接至pMD18-T载体、转化DH5α感受态细胞，涂板，筛选阳性克隆并增菌培养，提取质粒进行PCR、酶切及测序鉴定。经鉴定正确的阳性重组质粒作为标准品，分别命名为pPEDV-N、 pTGEV-M、 pPDCoV-M、 pPRoV-VP6。应用核酸蛋白分析仪测定浓度，计算拷贝数：拷贝数 =质粒浓度×6.02×1023/(660×质粒总长度)。

1.6 反应条件的优化和标准曲线的建立 将4种重组质粒标准品pPEDV-N、pTGEV-M、pPDCoV-M、pPRoV-VP6作为模板，应用4对特异性引物和Taq-Man探针，在同一反应体系中进行多重TaqMan荧光定量PCR扩增，采用方阵实验分别对退火温度(52℃、54℃、56℃、58℃、60℃、62℃)、引物浓度(终浓度分别为 0.2 pmol/μL、0.3 pmol/μL、0.4 pmol/μL、0.5 pmol/μL)和探针浓度(终浓度分别为 0.2 pmol/μL、 0.3 pmol/μL、 0.4 pmol/μL、 0.5 pmol/μL)进行优化，在Ct值≤35个循环时判定结果，以获得TaqMan荧光定量PCR的最佳反应条件。

将4种重组质粒标准品10倍系列稀释成2.06×109拷贝 /μL～2.06×103拷贝 /μL 后分别作为模板，按照优化的TaqMan荧光定量RT-PCR反应条件进行扩增，绘制扩增曲线及标准曲线。

1.7 特异性试验 取 PEDV、TGEV、PDCoV、PRoV、PRRSV、CSFV和 FMDV病毒液，利用RNA/DNA抽提试剂盒抽提总RNA并反转录成cDNA；取 PCV2、PPV和 PRV病毒液，利用 RNA/DNA抽提试剂盒抽提总DNA。以上述cDNA和DNA为模板，设重组质粒作为阳性对照，双蒸水为阴性对照，利用所建立的多重TaqMan荧光定量RT-PCR进行检测，评价其特异性。

1.8 敏感性试验 将4种重组质粒标准品pPEDVN、pTGEV-M、pPDCoV-M、pPRoV-VP6进行10倍系列稀释，选取终浓度为2.06×109拷贝/μL～2.06×100拷贝/μL的质粒等比例混合物作为模板，利用建立的TaqMan荧光定量PCR进行扩增，检验其敏感性。

1.9 重复性试验 将4种重组质粒pPEDV-N、pTGEV-M、pPDCoV-M、pPRoV-VP6分别10倍系列稀释后等比例混合，取3个浓度梯度(终浓度分别为2.06×108拷贝 /μL、2.06×106拷贝 /μL、2.06×104拷贝/μL)质粒混合物，利用建立的TaqMan荧光定量PCR扩增，进行组内重复性试验；经同样方法对不同批次提取的重组质粒进行组间重复试验。评价该方法的重复性。

1.10 临床样品检测 利用本实验室前期建立的多重RT-PCR方法[7]以及本研究所建立的多重TaqMan荧光定量RT-PCR方法对1.4中提取的243份临床样品基因进行检测，比较两者检测PEDV、TGEV、PDCoV、PRoV的结果，计算二者符合率。

2 结果

2.1 重组质粒标准品的构建 提取PEDV、TGEV、PDCoV、PRoV病毒液总RNA，反转录成cDNA后作为模板，应用特异性引物进行PCR扩增，获得PEDV N基因(140 bp)、TGEV M基因(102 bp)、PDCoV M基因(72 bp)、PRoV VP6基因(107 bp)片段，与各自目的片段大小一致(图略)。经回收、连接、转化，阳性克隆提取质粒，进行PCR鉴定、酶切鉴定和测序鉴定，结果显示与预期一致。表明构建了4种重组质粒，分别命名为pPEDV-N、pTGEV-M、pPDCoV-M、pPRoV-VP6，经检测浓度，换算成拷贝数依次为 2.57×1010拷贝 /μL，2.62×1010拷贝 /μL、3.43×1010拷贝 /μL、4.67×1010拷贝 /μL，将其分别作为质粒标准品。

2.2 多重TaqMan荧光定量RT-PCR反应条件的确定 经过优化，多重TaqMan荧光定量RT-PCR的最佳反应体系为25 μL：Premix ExTaqTM(Probe qPCR)12.5 μL，PEDV-N和PRoV-VP6上、下游引物(25 pmol/μL)及探针(25 pmol/μL)各 0.5 μL(终浓度 均 为 0.50 pmol/μL)，TGEV-M 和 PDCoV-M 上 、下游引物(25 pmol/μL)及探针(25 pmol/μL)各 0.3 μL(终浓度均为 0.30 pmol/μL)，模板 2 μL，灭菌双蒸水5.7 μL。扩增程序为：95℃20 s；95℃1 s，58℃45 s，40个循环，同时收集荧光信号。

2.3 多重TaqMan荧光定量RT-PCR标准曲线的建立 将pPEDV-N、pTGEV-M、pPDCoV-M和pPRoV-VP6质粒标准品10倍系列稀释成2.06×109～2.06×103拷贝/μL，等比例混合后作为模板进行扩增，获得多重TaqMan荧光定量RT-PCR的扩增曲线和标准曲线(图1)。结果显示，4种标准曲线的相关系数(R2)均在0.998以上，表明各种标准品的起始模板数和Ct值之间均呈现良好的线性关系。

2.4 特异性分析 以 PEDV、TGEV、PDCoV、PRoV、PRRSV、CSFV、FMDV的 cDNA和 PCV2、PPV和PRV的DNA为模板，以灭菌双蒸水为阴性对照，利用建立的多重TaqMan荧光定量RT-PCR进行特异性检测。结果显示，只有作为阳性对照的pPEDV-N、pTGEV-M、pPDCoV-M、pPRoV-VP6质粒标准品以及以PEDV、TGEV、PDCoV和PRoV的cDNA出现特异性扩增曲线，而且Ct值均小于35个循环，其余病毒的cDNA或DNA以及阴性对照均无扩增曲线(图2)。表明所建立的多重TaqMan荧光定量RT-PCR方法具有较强的特异性。

2.5 敏感性分析 将pPEDV-N、pTGEV-M、pPDCoV-M和pPRoV-VP6质粒标准品10倍系列稀释后等比例混合作为模板，结合循环数进行多重Taq-Man荧光定量PCR的敏感性试验。结果显示，循环数在35以下时，该方法对pPDCoV-M的检出下限为2.06×101拷贝 /μL、对 pPEDV-N、pTGEV-M 的检出下限为 2.06×102拷贝/μL、对pPRoV-VP6的检出下限为2.06×103拷贝/μL(图 3)。表明该方法具有较高的敏感性。

2.6 重复性分析 对所建立的多重TaqMan荧光定量RT-PCR进行重复性试验。结果显示，组内及组间重复性试验Ct值的变异系数均小于1.1%(表2)，表明该方法具有良好的重复性。

2.7 临床样品的检测结果 利用所建立的多重TaqMan荧光定量RT-PCR方法，对2018年采集自广西各地的243份临床腹泻病料样品进行检测，同时利用本实验室已建立的PEDV、TGEV、PDCoV、PRoV多重RT-PCR方法[7]对相同病料进行检测，结果见表3，经计算分析两种方法检测样品阳性结果的符合率为96.71%。表明本研究所建立的多重TaqMan荧光定量RT-PCR可以用于临床检测，临床存在这4种病原的混合感染，应引起重视。

表2 多重TaqMan荧光定量RT-PCR的重复性试验

表3 临床腹泻样品的检测结果

3 讨论

由PEDV、TGEV、PDCoV、PRoV引起的仔猪临床症状和病理解剖变化极为相似，并且混合感染和继发感染普遍，给临床诊断造成极大困难[8-9]，需要利用实验室检测技术鉴别病原。荧光定量RT-PCR具有灵敏、高效、可定量、高通量、无污染等优点，在病原学检测中得到广泛应用。Seong等[10]、侯月娥等[11]建立了同时检测TGEV、PEDV的多重TaqMan荧光定量RT-PCR方法，许梦怡[12]、刘邓等[13]、李军[14]等建立了PEDV、TGEV、PRoV多重TaqMan荧光定量RT-PCR方法，罗尚星等[15]建立了PDCoV、PEDV多重TaqMan荧光定量 RT-PCR方法，张利卫等[16]建立了 PDCoV、PEDV多重SYBR Green I荧光定量RT-PCR方法，陈小金等[17]、吴洋等[18]建立了PEDV、TGEV、PRoV多重SYBR Green I荧光定量RT-PCR方法。但是，迄今未见同时检测并区分PEDV、TGEV、PDCoV、PRoV多重TaqMan荧光定量RT-PCR方法的报道。本研究针对PEDV N基因、TGEV M基因、PDCoV M基因和PRoV VP6基因保守区域设计特异性引物和TaqMan探针，通过优化各种反应条件，建立了特异性强、敏感性高、重复性好的PEDV、TGEV、PDCoV和PRoV多重TaqMan荧光定量RT-PCR检测方法。应用该方法检测采集自广西的243份临床样品，检出阳性样品96份(42.79%)，其中TGEV阳性样品38份(15.64%)、PEDV阳性样品 29份(11.93%)、PRoV阳性样品23份(9.47%)、PDCoV阳性样品22份(9.05%)，并且混合感染阳性样品8份(3.29%)。近年，许梦怡检测采自江苏省的40份临床病料，结果显示TGEV阳性2份(5%)、PEDV阳性12份(30%)、PRoV阳性5份(12.5%)，其中TGEV和PEDV混合感染1份(2.5%)、PEDV和PRoV混合感染2份(5%)[12]。罗尚星等检测采自河北省的130份仔猪腹泻样品，结果显示PDCoV检出率为16.9%，PEDV检出率为66.2%，二者混合感染的检出率为2.3%[15]。张利卫等检测采自河南省的198份腹泻样品，结果显示PDCoV阳性率为20.7%、PEDV阳性率为29.8%、PDCoV和PEDV混合感染率为8.6%[16]。赵津等报道，云南省47份仔猪腹泻病料中PEDV、TGEV、PRoV的阳性率分别为 55.32%、6.38%、14.89%[19]。任玉鹏等报道，四川省222份仔猪腹泻病料中PEDV、TGEV、PDCoV的阳性率分别为52.2%、2.7%、2.3%[20]。同时，均存在多种病原的混合感染。以上结果表明，PEDV、TGEV、PDCoV、PRoV在仔猪中普遍存在，且检出率在国内不同地域有所差异，但以PEDV为主，同时PDCoV、TGEV、PRoV也很普遍，不容忽视。

本研究建立了PEDV、TGEV、PDCoV、PRoV多重TaqMan荧光定量RT-PCR鉴别检测方法，具有特异性强、敏感性高、重复性好的特点，为4种病毒的快速鉴别检测及流行病学调查提供了有效的技术手段。