放线菌KN37菌株代谢物对番茄灰霉病的防治

邵胜楠，张安琪，巴尔那·库马尔，张国强

(石河子大学 农学院 / 新疆绿洲农业病虫害治理与植保资源利用重点实验室，新疆 石河子832003)

番茄灰霉病是由灰葡萄孢菌(Botrytiscinerea)引起的一种重要的世界性番茄病害，该病害主要危害果实，造成果实腐烂，也可危害叶、茎和花，造成严重减产，产量损失高达20%～50%[1]。番茄灰霉病可通过气流、雨水、昆虫等方式进行多次侵染，而且发病后传播速度很快，对保护地番茄生产威胁极大。该病害已在全国各地普遍发生，且呈上升趋势，已成为番茄设施栽培的主要危害因素[2]。目前，防治番茄灰霉病以化学农药为主，如代森锰锌、嘧霉胺、异菌脲、腐霉利等。这些药剂长时间、大剂量地使用，对环境和食品安全产生了大量负面影响，同时还产生了严重的抗药性[3-4]。微生物的代谢产物是一个巨大的天然产物资源库，从中筛选新农用活性物质是一条相对便捷的道路[5]。而且微生物源农药相对于化学农药具有低成本、高活性、低毒、环保等特点，因此以微生物天然产物为基础，开发新型微生物源农药，可有效解决番茄灰霉病的危害。因此，本课题组深入挖掘了新疆高寒地区的放线菌资源，从中发现了具有较好抑菌活性的放线菌KN37。本研究主要对放线菌KN37菌株代谢物的抑菌谱进行了广泛测定，同时利用离体法和活体法系统研究了菌株代谢物对番茄灰霉病的防治效果，旨在为KN37菌株的进一步研究与开发奠定基础。

1 材料与方法

1.1 供试放线菌 放线菌KN37，分离自新疆喀纳斯地区，保存于石河子大学农学院植保系农药实验室。

1.2 供试病原菌 番茄灰霉病菌(Botrytiscinerea)、番茄细菌性斑点病菌(Pseudomonassyringae)、油菜菌核病菌(Sclerotiniasclerotiorum)、黄瓜黄萎病菌(Verticilliumdahliae)、稻瘟病菌(Phyriculariagrisea)、小麦赤霉病菌(Fusariumgraminearum)、立枯病菌(Alterariaalternata)、番茄早疫病菌(Alternariasolani)、白菜黑斑病菌(Alternariasolani)、玉米小斑病菌(Helminthosporiummaydis)、棉花枯萎病菌(Fusariumoxysporum)、葡萄白腐病菌(Coniothyriumdiplodiella)均由石河子大学农学院植保系病理实验室提供。

1.3 供试培养基 高氏1号培养基：KNO31 g，K2HPO40.5 g，NaCl 0.5 g，MgSO4·7H2O 0.5 g，FeSO4·7H2O 0.01 g，可溶性淀粉20 g，琼脂20 g，蒸溜水1 000 mL，pH 7.2～7.4。PDA培养基：去皮马铃薯200 g，葡萄糖20 g，琼脂20 g，蒸馈水1 000 mL。

1.4 发酵液的制备 用打孔器取直径4 mm的菌饼6个，置于配好的高氏一号液体培养基中掁荡培养。摇床培养温度为28 ℃，转速为120 r·min-1，培养7～10 d。发酵液经6 000 r·min-1离心30 min后，取上清待用。

1.5 发酵液提取物的制备 喷雾干燥器对菌株发酵液进行浓缩，对干粉进行复溶和过滤后用大孔吸附树脂AB-8进行分离，用25%乙醇/水进行洗脱，将洗脱液浓缩后用乙酸乙酯进行液液萃取，然后将乙酸乙酯相浓缩后得到菌株发酵液的提取物。

1.6 抑菌活性测定方法 (1)菌丝生长速率法：将PDA培养基与发酵液或提取物按9∶1混合均匀，制成培养基平板，分别从供试病原菌的菌落边缘，用打孔器切成直径为4 mm的菌饼，分别放置于培养基中央，使菌饼带菌丝的一面贴在培养基表面，空白对照不加放线菌KN37发酵液，每个处理重复3次。置于28 ℃恒温箱中培养72～96 h后，用“十”字交叉法测量供试病原真菌菌落生长直径，计算菌丝生长抑制率[6]。菌丝生长抑制率=(对照菌落生长直径-处理菌落生长直径)/(对照菌落生长直径-菌柄直径)×100%。(2)孢子萌发法：取供试病原菌孢子配成106CFU·mL-1悬浮液，在低倍镜下的每个视野里有30～40个孢子，将发酵液或提取物与供试菌株的孢子悬浮液1∶1混合，每处理重复3次，在28 ℃下培养12 h后观察计算孢子萌发率以及抑制率[7]。孢子萌发率/%=萌发孢子数/孢子总数×100%；孢子萌发抑制率/%=(对照孢子萌发率-处理孢子萌发率)/对照孢子萌发率×100%。(3)活体组织法：采摘大小均一、健康新鲜的番茄果实。表面用0.1% NaClO溶液消毒晾干后，接种番茄灰霉病菌菌饼；保护作用测定方法为将发酵液提取物(400 mg·L-1)喷施于番茄果实表面，22 ℃保湿培养24 h后接种番茄灰霉病菌菌饼；治疗作用测定方法：在保湿条件下接种番茄灰霉病菌菌饼，24 h后再喷施供试药液。药剂对照为腐霉利400 mg·L-1，2个菌丝块/果实试验重复3次，5 d后调查病斑大小，计算药效[8]。药效/% =(对照病斑直径-处理病斑直径)/对照病斑直径×100%。(4)田间试验：于石河子大学试验站温室大棚种植番茄，试验共设3个处理，处理1：空白对照；处理2：施用腐霉利(400 mg·L-1)；处理3：施用发酵液提取物(400 mg·L-1。每个处理3次重复，随机区组排列，小区面积20 m2，株数36株每小区第一次施药前调查病情基数，每隔7 d施药1次，共施药3次，施药后7 d调查发病情况，5点取样，每点调查3株番茄全株叶片，统计发病情况并计算病情指数和防治效果[9]。病情分级标准如下：

0级——无病斑；

1级——病斑占整个叶面积5%以下；

3级——病斑占整个叶面积5%～15%；

5级——病斑占整个叶面积16%～25%；

7级——病斑占整个叶面积26%～50%；

9级——病斑占整个叶面积51%以上。

根据调查结果计算病情指数和防效。病情指数=∑(各级病叶数×相对应极值)/调查总叶数×9；防治效果=(1-空白对照区施药前病情指数×药剂处理区施药后病情指数/空白对照区施药后病情指数×药剂处理区施药前病情指数)×100%。

1.7 放线菌KN37菌株的初步鉴定 (1)菌丝形态观察：采用插片法接种菌株，用移液抢吸取50 μL孢子悬浮液于高氏一号培养基上，用涂布器将其涂布均匀，将盖玻片斜插入培养基中，28 ℃条件下5 d后，待菌丝覆盖于盖玻片与培养基交叉处时，取下插片，置于光学显微镜下观察其观察菌株的基内菌丝、气生菌丝颜色和孢子及孢子丝形态。参考阮继生等人的方法对待测菌株进行形态观察和显微结构鉴定[10]。(2)菌落形态观察：将少量的抱子丝接种于高氏一号培养基上，使其形成单菌落，28 ℃条件下5 d后，观察菌落的形状、颜色、质地，以及平板正、反面的特征等一系列的形态特点。(3)分子鉴定：利用EasyPure Bacteria Genomic DNA Kit(全式金，中国)进行放线菌基因组DNA提取，参考王秀爽等人的方法使用通用引物8F(5′-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3′)和1492R(5′-TACG GCTACCTTGTTACGACTT-3′)对16S rDNA进行扩增[11]，PCR产物测序后进行Blast，选择同源性较高的菌株用MEGA7.0软件进行多序列比对，构建系统发育树。

2 结果与分析

2.1 放线菌KN37代谢物的抑菌谱 放线菌KN37发酵液对多种植物病原菌具有较强的抑制作用(表1)，尤其是对番茄灰霉病菌、细菌性斑点病菌、番茄早疫病菌和油菜菌核病菌的抑制效果最好，抑制率分别为94.26%，93.66%，92.07%和95.67%。

表1 放线菌KN37发酵液对12种病原菌的菌落生长抑制作用

注：抑制率为平均值±标准差(n=4)

Note：Inhibition rate is mean values ± SE(n=4)

2.2 放线菌KN37代谢物对番茄灰霉病菌的抑制作用 为了进一步明确KN37菌株代谢物的抑菌效果，采用菌丝生长速率法对KN37发酵液及其乙酸乙酯提取物的毒力进行测定，结果显示KN37发酵液的EC50为134.035 9 mg·L-1，乙酸乙酯提取物对番茄灰霉病菌的EC50为37.864 3 mg·L-1，均高于对照药剂腐霉利的EC50值。

表2 放线菌KN37发酵液及提取物对番茄灰霉病菌菌丝生长的毒力

此外，放线菌KN37发酵液及其提取物也能显著抑制番茄灰霉病菌孢子的萌发，其中发酵液处理孢子12 h后的EC50为40.300 5 mg·L-1(y= 3.233 3 + 1.100 5x，r= 0.982 0)，发酵液提取物的EC50为6.713 4 mg·L-1(y= 3.860 1 + 1.378 4x，r= 0.991 7)。KN37代谢物对孢子萌发的毒力显著高于对菌丝生长的毒力，说明番茄灰霉病菌的孢子对KN37代谢物更为敏感。

2.3 放线菌KN37代谢物对番茄灰霉病的防治效果 组织法测定结果表明，KN37发酵液提取物(400 mg·L-1)对番茄灰霉病具有较强的防治效果(图1A)，其中保护作用(96.72%)与对照药剂腐霉利(400 mg·L-1)效果相当，而治疗作用(77.58%)显著优于对照药剂。从图1B可以看出，KN37发酵液提取物施于番茄果实表面后，病原菌无法深入侵染；即使病原菌已经侵染，KN37发酵液提取物也能在一定程度上限制其进一步扩展，从而防止果实大面积腐烂的情况发生。

图1 放线菌KN37代谢物对番茄灰霉病的保护与治疗作用

利用KN37发酵液提取物(400 mg·L-1)防治温室大棚内的番茄灰霉病，结果表明，在施用3次发酵液后番茄灰霉病的发生率明显降低，对番茄灰霉病的防治效果可达63.12%，与对照药剂腐霉利效果(400 mg·L-1)相当(图2A)，且番茄植株更加粗壮，叶片更绿(图2B)。推测KN37代谢物中不仅含有抑菌物质，还可能含有一些可以促进植物生长或诱导植物抗性的物质。

图2 放线菌KN37代谢物对温室大棚番茄灰霉病的防治效果

图3 放线菌KN37菌落(A)及孢子丝形态(B)Fig.3 Colony (A) and sporotrichial (B) of actinomycete strain KN37

2.4 放线菌KN37初步鉴定 放线菌KN37在高氏1号固体培养基上生长状况良好，菌落呈乳白色，圆形，质地致密，表面干燥，内源有凹陷中间有突起皱褶，菌落周围呈辐射状(图3A)。气生菌丝颜色为乳白色，发育良好，可生成多个长椭圆形孢子，孢子丝呈螺旋状生长(图3B)。基内菌丝为白色，无色素分泌。通过利用16S rDNA进行BLAST序列比对，发现KN37菌株与Streptomyceskanamyceticus(NR 043822)的16S rDNA序列相似度达到96%，最为近缘(图4)。结合形态观察结果和分子鉴定结果，可将放线菌KN37归属为白色链霉菌类群。

图4 基于16S rDNA序列分析的放线菌KN37系统发育树

3 讨 论

新疆喀纳斯地区生态环境特殊，具有丰富的微生物资源。从当地分离得到的放线菌数量较多，其中不乏一些具有较好生物活性的菌株。韩立荣等人曾从喀纳斯地区土壤中分离得到1株新放线菌StreptomyceskanasensisZX01，该菌可产生一种抗植物病毒的糖蛋白GP-1，同时，还可诱导植物产生抗病性，极具开发价值[12-13]。本课题组针对新疆高寒地区放线菌资源进行深度挖掘，目前已对天池和喀纳斯地区放线菌进行了研究，从中发现具有农用活性的放线菌数量占分离得到放线菌总数的7.32%，相比青藏高原地区(5.73%)较高[14]。由此可见，新疆高寒地区放线菌资源极为丰富，有待进一步开发利用。

放线菌KN37发酵液的抑菌谱测定结果表明，其对多种植物病害均具有较好的抑制效果，如番茄灰霉病、番茄早疫病、番茄细菌性斑点病等。此外，毒力测定表明，发酵液提取物对番茄灰霉病菌的毒力较强，对菌丝生长的EC50为37.859 6 mg·L-1，对孢子萌发的EC50为6.713 4 mg·L-1。以上结果表明，KN37菌株代谢物具有高效、广谱的杀菌特点，可进一步分离纯化得到抑菌化合物后开展农药制剂开发研究。

分子鉴定结果表明，S.kanamyceticus和KN37菌株的近缘菌(16S rDNA序列相似度为96%)，该菌为卡那霉素的产生菌。卡那霉素广泛应用于医疗、畜牧及分子生物学方面，主要抑制细菌的蛋白质生物合成[15]。卡那霉素本身不可抑制真菌生长，但有研究发现卡那霉素经过结构改造后可抑制真菌生长[16]。通过文献调研，未发现S.kanamyceticus代谢物具有抗真菌活性.因此,结合16S rDNA分析结果可推断KN37菌株与S.kanamyceticus并非同一种菌，下一步可结合代谢物分析及多项分类法对KN37菌株进行鉴定。