基于密码子优化的FAD依赖葡萄糖脱氢酶在毕赤酵母中的高效表达及酶学性质

董聪 高庆华 王玥 罗同阳

（河北省科学院微生物研究所，保定 071051）

FAD 依赖的葡萄糖脱氢酶（FAD-dependent glucose dehydrogenase，简称 FAD-GDH，EC 1.1.99.10），同葡萄糖氧化酶、吡喃糖脱氢酶、胆碱脱氢酶和甲醇氧化酶一样都属于 GMC 氧化还原酶（Glucosemethanol-choline-oxidoreductase） 家 族［1］。 它 是 以FAD 为辅基能够在 NAD（P）+等存在的情况下催化β-D-葡萄糖生成 D-葡萄糖酸-δ-内酯，而 D-葡萄糖酸-δ-内酯会自发形成葡萄糖酸。

研究表明，FAD-GDH是一类重要的临床检测和工业用酶，可应用于血糖试纸或葡萄糖生物传感器的制备、辅酶的再生、新型燃料电池［2］和心脏起搏器［3］的研制等。尤其是可以作为血糖检测用酶，FAD-GDH不以氧气作为酶促反应的电子受体，检测结果更准确，且具有转化率高、底物特异性好等优点，因此有很大的应用前景。

虽然到目前为止已经有不少FAD-GDH被分离和鉴定，但是针对特定FAD-GDH全面深入的研究很少，主要原因是FAD-GDH很难实现可溶的重组表达，在大肠杆菌进行重组表达时形成包涵体，不易分离纯化。重组表达是克服这一障碍的有效方法。在真核表达系统，毕赤酵母中有过实现可溶表达，得到有活性的FAD-GDH的报道［4］。毕赤酵母（P. pastoris）表达系统在进行外源基因表达时，具有生长周期短、可进行胞外分泌表达、目的蛋白易于纯化和易于高密度发酵培养等优点［5-7］。由于毕赤酵母对密码子的偏爱性，目的基因的密码子序列对产物的表达量也有很大影响。大量研究表明，密码子优化对提高产物表达量有明显的作用［8-13］。因此，如果想提高产物的产量，不但要优化表达条件，还需要对密码子进行优化，以期为FAD依赖的葡萄糖脱氢酶进一步扩大生产提供理论和技术支持，使其更好的应用于血糖检测及其他相关领域［14］。

本研究以NCBI上登录号为XM_001216916的土曲霉NIH2624基因为基础，根据毕赤酵母的密码子偏爱性对该基因的密码子进行优化，然后委托公司进行基因合成。接着将该基因克隆到毕赤酵母中，并在基因的3′端接上6个组氨酸标签的核苷酸序列，以便于重组表达蛋白的纯化。经过筛选和优化，得到了高产该FAD-GDH的重组菌株。采用该菌株摸索发酵条件，实现了该蛋白的高效表达，并对其酶学性质进行了研究。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 菌株和质粒 FAD依赖葡萄糖脱氢酶基因由安徽通用生物公司合成，合成的基因连接在pUC57T载体上；大肠杆菌DH5α购自上海生工；酵母表达菌株X33由中科院微生物研究所提供；质粒pMD由本实验室前期构建。

1.1.2 酶和主要试剂EcoR I、NotI和SacI限制性内切酶为NEB公司产品；T4 DNA连接酶为Thermo公司产品；DNA Marker、DNA凝胶回收试剂盒和质粒DNA小提试剂盒为天根生化科技有限公司产品；G418为Sigma公司产品；2，6-二氯靛酚钠（DCIP）为BBL Life Sciences公司产品，BeyoGoldTMHis-tag Purification Resin为碧云天生物科技有限公司产品；其他试剂均为国产分析纯试剂。

1.1.3 培 养 基 LB、YPD、YPDS、YPCS、BMGY和基础盐培养基等培养基配方和X33培养条件参照文献［14］。

1.2 方法

1.2.1 葡萄糖脱氢酶密码子优化及人工合成 以NCBI 上登录号为 XM_001216916 的土曲霉 NIH2624基因为基础，根据毕赤酵母的密码子偏爱性对该基因的密码子进行优化，利用密码子优化软件http：//www.jcat.de/分析，发现蛋白酶基因中有多处是毕赤酵母的稀有密码子，利用密码子优化软件http：//www.jcat.de/，对蛋白酶基因进行密码子优化，在不改变氨基酸序列的前提下，获得优化后的蛋白酶的基因序列。利用信号肽预测服务器SignalP，服务器网址http：//www.cbs.dtu.dk/services/SignalP/，预测信号肽，然后去除，在序列的5′ 端加上EcoR I酶切位点，3′端加上6个组氨酸标签后再加NotI酶切位点。然后将优化构建的基因序列送安徽通用生物公司合成，合成的基因连接在pUC57T载体上。

1.2.2 重组表达载体的构建 人工合成的pUC57-GDH和载体pMD经EcoR I和NotI双酶切后切胶回收纯化，然后用T4 DNA连接酶连接，转化大肠杆菌DH5α感受态细胞中，在含氨苄的LB平板上筛选阳性克隆，对阳性克隆提取质粒进一步进行酶切验证，由安徽通用生物公司进行测序分析。

1.2.3 阳性转化子的获得 构建好的重组表达载体pMD-GDH经SacI线性化后电转表达宿主P. pastorisX33感受态细胞，电转条件：4 Kv，3 ms，然后快速加入1 mL 预冷YPDS液体培养基，于30℃培养箱静置培养2-6 h，涂布在终浓度为250 μg/mL G418的YPD平板上，3 d后获得阳性转化子。

1.2.4 重组蛋白的诱导表达 将重组菌株X33/pMDGDH挑取单菌落接种于5 mL YPCS试管培养基中，14-18 h后加 1%（V/V）甲醇，之后24 h和48 h后均各加 1%（V/V）甲醇诱导，72 h收菌，8 000 r/min离心 5 min收集上清，测定酶活。至少重复3次。

1.2.5 FAD依赖葡萄糖脱氢酶的酶活测定 FAD依赖葡萄糖脱氢酶的酶活测定方法参照文献［4］，使用DCIP作为电子受体，在30℃反应180 s，测定520nm的吸光值变化。

1.2.6 FAD依赖葡萄糖脱氢酶酶学性质分析 酶的最适作用温度和pH 以及热稳定性、pH稳定性测定、金属离子的影响及底物特异性参照文献［14］。所用的缓冲液均为pH 5.2的磷酸盐缓冲液。

1.2.7 10 L发酵罐放大表达FAD-GDH 选取试管水平上FAD依赖的葡萄糖脱氢酶活性最高的转化子，在10 L 发酵罐条件下进行FAD-GDH 的表达。挑单克隆接种于YPD培养基培养10 h，按3%接种量转接于 100 mL BMGY 培养基至OD600≈6 接种于10 L发酵罐，初期装液量为 5.6 L BSM 培养基，高压灭菌20 min 后，以 10%发酵体积接种。期间每隔24h加维生素C水溶液（终浓度80 μg/L），28℃培养，每12 h取样测定发酵液酶活；上清液进行10% 聚丙烯酰胺凝胶电泳，观察FAD-GDH 蛋白质的表达。具体方法参照文献［15］。

2 结果

2.1 FAD依赖葡萄糖脱氢酶密码子优化

主要优化指标为CAI、密码子使用相对分布、GC含量、酶切位点等，在不改变氨基酸序列的前提下，在这段优化的密码子序列中，共替换了416个碱基，优化后的密码子序列几乎全部是毕赤酵母的偏爱密码子，为目的基因在毕赤酵母中成功表达提供了保障。基因序列如图1 所示。

2.2 酵母表达载体pMD-GDH的构建

将人工合成包含目的基因的载体和pMD载体分别利用EcoR I和NotI双酶切，并且利用琼脂糖凝胶回收试剂盒回收目的片段和表达载体片段，然后利用T4 DNA连接酶将目的片段连接到表达载体上，并转化大肠杆菌DH5α中，通过提取质粒，EcoR I/NotI双酶切鉴定质粒的正确性（图2）。有 1.7 kb左右的条带，说明FAD-GDH基因连接到了pMD载体上，然后将pMD-GDH质粒送华大基因测序，测序结果说明目的基因已连接到载体上，且序列正确。

2.3 阳性转化子的获得

将酶切正确的重组质粒pMD-GDH进行SacI线性化后电转表达宿主Pichia pastorisX33，构建重组菌X33/pMD-GDH，涂布在终浓度为250 μg/mL G418的YPD平板上，3 d后获得阳性转化子（图3）。

将重组菌株X33/pMD-GDH挑取单菌落接种于5 mL YPCS试管培养基中，14-18 h后加 1%（V/V）甲醇，之后24 h和48 h后均各加 1%（V/V）甲醇诱导，96 h收菌，8 000 r/min离心 5 min收集上清，上清液利用DCIP的方法测定 FAD 依赖葡萄糖脱氢酶的活力，酶活定义为反应体系中每分钟反应1 μmol电子受体所需的酶量，并以此来确定重组子是否为阳性。共挑取了18个单菌落诱导培养，测定酶活，重复3次，其中9号酶活较高且稳定（图4），试管中酶活为20.85 U/mL，选其做进一步的研究。

2.4 SDS-PAGE电泳分析

将在试管中诱导表达收集的酶液经超滤浓缩后进行SDS-PAGE电泳鉴定，结果如图5所示，重组毕赤酵母在60-70 kD之间有一条条带，与理论分子量相符，而pMD空载转化的酵母没有类似的条带。并且用DCIP法测定发酵液有活性，说明FAD依赖的葡萄糖脱氢酶在酵母体内实现了分泌表达。该基因3′端有His-tag序列，可通过与镍离子的亲和层析进行纯化，经BeyoGoldTMHis-tag Purification Resin纯化后SDS-PAGE分析结果如图6所示。

2.5 FAD依赖的葡萄糖脱氢酶酶学性质分析

酶学性质分析结果如图7-图9所示，毕赤酵母表达的FAD-GDH最适反应温度为55℃，在50℃下处理150 min仍有70%的活性。FAD-GDH的最适pH值为7.0，在 pH 4-7 范围内，37℃保温4 h，FAD-GDH 仍能保持 50%以上的活性。金属离子Cu2+对酶活抑制作用比较大。FAD-GDH的底物专一性较好，以葡萄糖为最适底物。当以木糖为底物时，其相对活性是以葡萄糖为底物的36%；对麦芽糖和海藻糖也有一定活性，对其他单糖或二糖不显示催化活性。

图1 优化后的FAD-GDH基因序列

2.6 10 L发酵罐扩大培养

重组菌P. pastorispMD-GDH在10 L发酵罐的放大培养，在菌体生长阶段当溶氧DO值在20 h迅速上升（培养基甘油耗尽）时以恒速补加甘油4 h，饥饿培养0.5 h 后开始甲醇诱导。在甲醇诱导阶段，通过控制DO 值来流加甲醇以高效诱导重组毕赤酵母产酶，同时可避免过高的甲醇对菌体产生毒害作用，甲醇流加［6 mL/（h·L）］与DO 偶联，即DO 值高于0%时补加甲醇，维持DO 0%左右。随着甲醇添加，FAD依赖葡萄糖脱氢酶酶活不断提升，甲醇诱导136 h时酶活达到257.6 U/mL（图10）。此外，对不同时间点的发酵上清液进行SDS-PAGE 电泳分析，结果显示各上清液在SDS-PAGE 图中有一条清晰条带，该条带随发酵时间增加而变得浓重清晰，表明发酵上清液中FAD依赖的葡萄糖脱氢酶含量随着发酵时间增加而显著提高，与酶活增长趋势保持一致。

图2 pMD-GDH载体双酶切鉴定

图3 X33/pMD-GDH单菌落

图4 高产FAD依赖葡萄糖脱氢酶重组毕赤酵母的试管筛选

图5 重组蛋白的SDS-PAGE检测结果

图6 重组蛋白纯化结果

图7 FAD-GDH 酶学性质

图8 不同金属离子对 FAD-GDH 的影响

图9 FAD-GDH 的底物特异性

图10 上罐发酵实验

3 讨论

FAD依赖的葡萄糖脱氢酶作为血糖检测用酶有很大的应用前景，但是在天然宿主菌中的表达量很低，在大肠杆菌进行重组表达时形成包涵体，表达量低，不易分离［16］，给FAD依赖的葡萄糖脱氢酶的工业应用带来一定的限制，所以利用基因工程技术实现FAD依赖的葡萄糖脱氢酶的高效表达成了目前研究的重点。酵母表达系统作为一种真核表达系统，与原核表达系统相比，具有很多优势，如生长速度快，可使用高效的AOX 启动子以及可实现异源蛋白的分泌表达等优点，广泛用于各种具有工业用途的重组蛋白的生产［58，17］。

本实验利用酵母表达系统表达FAD依赖葡萄糖脱氢酶，通过分析影响表达量的因素，根据毕赤酵母对密码子的偏爱性对该基因序列进行了优化［18］，提高其表达量。蛋白酶传统分离纯化方法多采用超滤-阳离子柱-超滤-阴离子柱等步骤，工艺复杂，收率低。本研究在FAD依赖葡萄糖脱氢酶基因3′端加上了6 个组氨酸标签，可以通过亲和层析的方法进行纯化，效率高，适合大规模纯化。

在已有的报道中，杉木炭疽病菌来源的 FADGDH 在毕赤酵母中得到了较好的表达，通过采用 7 L 的发酵罐，发酵约 50.5 h，产量达到 48 000 U/L报道［14］。本实验利用酵母表达系统表达FAD依赖的葡萄糖脱氢酶，通过优化FAD依赖的葡萄糖脱氢酶密码子序列，在10 L发酵罐培养时经过136 h诱导培养，酶活达到257 600 U/L，是现有技术中报道的酶活的5.3倍。毕赤酵母可通过高密度发酵培养大量生产重组蛋白，在提高产量的同时有利于简化纯化步骤，降低生产成本。

酶学性质是表征一个酶的基本参数，通过酶学性质的测定和评估，可以了解一个酶的特有性质，为酶的应用和改造提供一系列必要的初始参数。在血糖检测用酶中，要求所用的酶有较高的催化效率，较窄的底物谱，良好的热稳定性［19］。周利伟等［14］报道的重组FAD-GDH最适温度为40℃，本研究毕赤酵母重组表达FAD-GDH的最适反应温度为55℃，且热稳定性良好，在50℃下处理150 min仍有70%的活性；其次该酶的最适pH值为7.0，在 pH4-7 范围内，37℃保温4 h，FAD-GDH 仍能保持 50%以上的活性，有较高的应用价值。金属离子Cu2+对该酶活抑制作用比较大，与前人研究结果一致。FADGDH的底物专一性较好，以葡萄糖为最适底物。当以木糖为底物时，其相对活性是以葡萄糖为底物的36%；对麦芽糖和海藻糖也有一定活性，与杨愈丰等［20］研究结果相符，对其他单糖或二糖不显示催化活性。

4 结论

本研究以 NCBI 上登录号为 XM_001216916 的土曲霉 NIH2624 基因为基础，根据毕赤酵母的密码子偏爱性对该基因的密码子进行优化，将该基因克隆到毕赤酵母中，经过筛选和优化，得到了高产FAD-GDH 的重组菌株。试管水平酶活达到20 850 U/L；在10 L发酵罐培养时经过136 h诱导培养，酶活达到257 600 U/L，是现有报道中酶活的5.3倍。然后研究了其酶学性质，pH、温度稳定性和底物专一性较好。