氮磷钾配施对瓦布贝母产量及总生物碱质量分数的影响

邓秋林，杨正明，陈 雨，张亚琴，雷飞益，李思佳，刘震东，陈兴福

(1.四川农业大学 农学院，成都 611130;2.四川新荷花川贝母生态药材有限公司，四川松潘 623301)

瓦布贝母[FritillariaunibracteataHsiao et K.C.Hsia var.wabuensis(S.Y.Tang et S.C.Yue)Z.D.Liu,S.Wang et S.C.Chen]为百合科贝母属植物，是川产道地药材川贝母的基源植物之一。瓦布贝母以鳞茎入药，具有清热润肺、化痰止咳、散结消痈的功效，用于治疗肺热燥咳、干咳少痰、阴虚劳嗽、痰中带血、瘰疬、乳痈、肺痈等症[1]。瓦布贝母主要分布于四川岷江上游山区的茂县、北川、松潘、黑水县境内，生长在海拔2500～3000m的灌木林、小乔木林下[2]。川贝母由于生境特殊、生长年限长、野生资源过度采挖等原因而日趋濒危[3]，然而川贝母的用量逐年增加，川贝母的人工栽培尤为重要。瓦布贝母易成活、产量高且质优，其引种栽培成功缓解了川贝药用资源紧张的问题，同时为促进川贝母野生资源的保护提供了保证。川贝母人工栽培虽然取得了一定的成果，但川贝母的资源量仍然不足，人工栽培技术的研究仍需要加强，以求达到高产和高效[2,4]，从而解决川贝药用资源短缺的问题。合理施肥有利于提高药材的产量与质量[5]。氮磷钾的施用会改善药用植物的性状，从而影响其产量和质量[6]。川贝母中含有多种化学成分，包括生物碱类和非生物碱类，其中生物碱是川贝母的特征成分，也是主要活性成分，常作为贝母类药物的指标成分[7]。张礼等[8]研究表明施肥水平是影响川贝母灯笼花期产量的主要因素；邓孔权[9]研究施肥对川贝母田间产量的影响结果表明，田间施用氮磷钾复合肥(氮磷钾为13∶5∶7)的增产效果可达到70%以上。夏进春等[10]研究结果表明氮磷钾肥的混合施用比单独施用效果好。马靖[11]通过“3414”田间试验表明，川贝母的需肥量小，5a年生川贝母的最佳施肥方案为氮肥10.91kg/hm2、磷肥0kg/hm2、钾肥26.85kg/hm2。刘洪见等[12]研究表明，氮肥、钾肥对浙贝母所起的增产效益并不显著，磷肥对其有极显著的增产效应。前人对瓦布贝母的研究主要集中资源分类[13-16]、化学成分[17-20]和药理作用[21-24]等方面，对其栽培技术的研究鲜有报道，生产上也鲜有合理的氮磷钾配施量。不同药材对氮磷钾的需求量及其比例不一样，氮磷钾对药材产量和药用成分含量的影响也各不相同[23-27]。本试验采用三因素五水平二次通用旋转组合设计方法，研究不同氮磷钾配施对瓦布贝母鳞茎产量及总生物碱质量分数的影响，明确瓦布贝母高产优质的氮磷钾配施量，为瓦布贝母合理施肥和提高肥料利用率提供科学依据，从而提高栽培瓦布贝母的产量和质量。

1 材料与方法

1.1 试验地概况

试验在四川省茂县松坪沟乡新荷花中药饮片股份有限公司川贝母标准化生产基地(32°19′N，103°49′E)进行，年均气温11.0 ℃，无霜期 215.4 d，年均日照1 549.4 h。。试验地基本养分状况：pH 5.7，有机质53.57 g/kg，碱解氮490.06 mg/kg，有效磷105.11 mg/kg，速效钾168.55 mg/kg。

1.2 试验材料

试验材料为5 a生瓦布贝母栽培品种，由四川省茂县松坪沟乡新荷花中药饮片股份有限公司川贝母标准化生产基地提供，试验材料经四川农业大学陈兴福教授鉴定为百合科贝母属植物瓦布贝母(F.unibracteatavar.wabuensis)。供试肥料为尿素(总N≥46%，甘肃刘化(集团)有限责任公司)、过磷酸钙(P2O5≥12%，四川省成都市青白江区磷肥厂)、硫酸钾(K2O≥60%，国投新疆罗布泊钾盐有限责任公司)。

1.3 试验设计

试验采用三因素五水平二次通用旋转组合设计，设置氮肥、磷肥、钾肥3个因素、5个水平 (表1)，共20个处理(表2)。各小区随机安排于试验地中。瓦布贝母于2016年8月栽种，小区面积1.5 m2(1.5 m×1.0 m)，株距10 cm、行距 15 cm，每个小区栽种贝母90粒，并称量，在栽培前施用15 000 kg/hm2的农家肥作为底肥。后期，除肥料施用外，其他处理与基地管理一致。氮肥、磷肥和钾肥均做追肥施用，分别在瓦布贝母齐苗期、开花期和挂果期施用，用量为总量的20%、40%和40%，施用时与小区土壤混匀后撒施。

表1 因素水平表Table 1 Factor level table kg/hm2

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表2 试验设计与实施方案Table 2 Experimental design and implementation plan g/m2

1.4 测定项目与方法

1.4.1 瓦布贝母产量 2017-08-06在瓦布贝母植株地上部分完全倒苗后进行采挖，分别按照试验小区的编号测定产量，并折算成单位面积产量，再与播种下去的鳞茎质量计算鳞茎増重率。

增重率=(采收时的鳞茎质量-播种时的鳞茎质量)/播种时的鳞茎质量×100%。

1.4.2 瓦布贝母总生物碱 精密称取西贝母碱对照品3.3 mg，用三氯甲烷溶液定容至25 mL容量瓶中。精密吸取标准溶液0、0.l、0.2、0.4、 0.6、1.0 mL，置于具塞试管中，分别补加三氯甲烷至10.0 mL，精密加入5 mL水、2 mL 0.05%溴甲酚绿缓冲液(取溴甲酚绿0.05 g，用0.2 moL/L氢氧化钠溶液6 mL使溶解，加磷酸二氢钾1 g，加水使溶解并稀释至100 mL，即得)，剧烈振摇1 min，分液放置30 min。取三氯甲烷层液，用干燥滤纸过滤，取续滤液，用紫外分光光度计测定415 nm波长下的吸光度，以吸光度为纵坐标，浓度为横坐标，绘制标准曲线。参照2015版《药典》[1]中的方法，略加改进，即取瓦布贝母粉末约1 g，精密称定，置平底烧瓶中，加浓氨试液1.5 mL，浸润1 h，加三氯甲烷-甲醇(体积比4∶1)混合溶液20 mL，置80 ℃水浴加热回流2 h，放冷，过滤，滤液置50 mL量瓶中，用适量三氯甲烷-甲醇(体积比4∶1)混合溶液洗涤药渣2～3次，洗液并入同一量瓶中，加三氯甲烷-甲醇(体积比 4∶1)混合溶液至刻度，摇匀。精密量取1 mL，置25 mL具塞试管中，水浴上蒸干，精密加入三氯甲烷10 mL使溶解，照标准曲线的制备方法，自“精密加入5 mL水”起，依法测定吸光度，从标准曲线上读出供试品溶液中西贝母碱的质量(mg)，计算，即得。

1.5 数据分析与处理

采用Excel 2016和DPS 7.05数据处理系统对文中数据进行方差分析，三元二次通用旋转设计原理建立数学模型。

2 结果与分析

2.1 数学模型的建立与检验

根据测得鳞茎增重率和总生物碱质量分数数据，通过二次通用旋转组合设计方法进行统计，见表3。

对上述方程进行失拟性检验，计算结果见表4。由表4可知，对Y1、Y2回归方程进行方差分析，Y1回归方程在F检验中，FR达到极显著水平，FLf不显著，表明该回归方程拟合度合理可靠，用其来预测增重率的数学模型可靠程度高。Y2回归方程在F检验中，FR达到显著水平，FLf不显著，表明该回归方程拟合度较好，该数学模型成立。

2.2 模型分析

2.2.1 主效应分析 一次项回归系数绝对值的大小可以直接比较各因素对瓦布贝母增重率和总生物碱质量分数的影响，试验中各因素对增重率影响的大小顺序为：磷肥(X2)>氮肥(X1)>钾肥(X3)，试验中各因素对总生物碱质量分数影响的大小顺序为：氮肥(X1)>钾肥(X3)>磷肥(X2)。

根据方程得出Y1(增重率)单因素回归方程效应影响图1，由图1可以看出，磷肥对瓦布贝母增重率影响呈先上升后下降的趋势。在 -1.682水平到0水平之间，随着磷肥用量的增加，增重率增加，在0水平达到最大，之后，随着施肥水平的增加，增重率减少。

表3 试验设计结构矩阵和试验结果Table 3 Experimental design structure matrix and test results

表4 试验结果的方差分析Table 4 Variance analysis of test results

注：*为差异显著(P<0.05)，**为差异极显著(P<0.01)。

Note：* show significant different(P<0.05)；** show extremely significant different(P<0.01).

根据方程得出Y2(总生物碱)回归方程效应影响图2。由图2可以看出，各因素对瓦布贝母总生物碱影响整体趋势呈先上升后下降。在 -1.682水平到0水平之间，随着施肥水平的增加，总生物碱质量分数增加，在0水平达到最大，之后，随着施肥水平的增加，总生物碱质量分数 减少。

图1Y1(增量率)单因素效应分析Fig.1Y1 (mass gain rate) single factor analysis

图2 Y2(总生物碱质量分数)单因素效应分析Fig.2 Y2 (total alkaloid mass fraction) single factor analysis

2.2.3 互作效应分析 由表4可知，X2X3对瓦布贝母增重率影响显著，X1X2和X1X3未达到显著；X1X3对瓦布贝母总生物碱质量分数的影响显著，X1X2和X2X3未达到显著。

由此方程可以计算出钾肥与磷肥的互作效应图3。由图3可以看出，不同水平磷肥、钾肥均影响瓦布贝母增重率的提高，磷肥和钾肥的互作效应有利于增重率的提高。在-1.682水平到-1水平l钾肥和1水平到1.682水平磷肥有利于增重率的提高，磷肥为1水平，钾肥为-1.682水平时，瓦布贝母的增重率达到最大。

由方程得到X1X3互作效应质量分数变化图4。

图3 磷、钾互作对增重率的影响Fig.3 Effects of phosphorus and potassium interaction on weight gain rate

图4 氮、钾互作对总生物碱质量分数的影响Fig.4 Effects of nitrogen and potassium interaction on total alkaloid content

由图4可以看出，不同水平的氮肥、钾肥均影响瓦布贝母总生物碱的积累，磷肥和钾肥的互作效应利于总生物碱的积累。在0水平到1水平氮肥和0水平到1水平钾肥有利于总生物碱的积累，氮肥和磷肥都在0水平时，瓦布贝母的总生物碱质量分数最高。

2.2.4 施肥方案的优选 以Y1(增重率)、Y2(总生物碱质量分数)方程作为相关函数，通过统计频数法选优分析得出符合相关目标的氮磷钾配施 方案。

综合考虑瓦布贝母的生产潜力以及茂县松坪沟乡的土壤状况，可将瓦布贝母增重率为 105.13%作为高产目标，利用统计频数法选优，计算试验处理全部实施时全部的理论产量。通过DPS 7.05软件分析可知，在组合方案中，产量预测值达到目标要求的有51个，结果见表5。通过对95%的置信区间分布进行计算，可优化出稳定的施肥范围。当施用氮肥7.79～12.00 kg/hm2、磷肥38.79～49.25 kg/hm2、钾肥15.39～24.49 kg/hm2时，瓦布贝母增重率大于105.13%。

表5 瓦布贝母增重率≥105.13%的方案频数分布Table 5 The program frequency distribution of Fritillaria unibracteata var.wabuensis weight gain rate≥105.13%

《中华人民共和国药典》[1]中要求，川贝母中总生物碱质量分数不得少于0.05%，根据《药典》指标的要求并结合本试验结果，将瓦布贝母中总生物碱质量分数大于0.37%定为高质量分数。在组合方案中，瓦布贝母中总生物碱质量分数大于 0.37%时有41个方案，结果见表6。通过对95%的置信区间分布进行计算，可优化出稳定的施肥范围。当施用氮肥8.98～12.96 kg/hm2、磷肥 26.63～43.37 kg/hm2、钾肥17.44～25.40 kg/hm2时，瓦布贝母总生物质量分数大于 0.37%。

综合考虑增重率和总生物碱质量分数，当施用氮肥8.98.79～12.00 kg/hm2、磷肥38.79～43.37 kg/hm2、钾肥17.44～24.49 kg/hm2时，可使瓦布贝母增重率大于105.13%，总生物碱质量分数大于0.37%。

表6 瓦布贝母总生物碱质量分数≥0.37%的方案频数分布Table 6 Program frequency distribution of Fritillaria unibracteata var.wabuensis total alkaloid mass fraction ≥0.37%

3 讨论与结论

氮磷钾被称为“肥料三要素”，过量或缺乏会影响药用植物的生长发育，同时，土壤中氮磷钾的质量分数也影响着药用植物对这些元素的吸收，从而影响中药材的品质。科学合理的施肥有利于药用植物的生长发育以及产量质量的形成。研究表明[28-29]氮磷钾合理配施可以促进黄芪的生长和干物质的积累，提高黄芪中毛蕊异黄酮苷、芒柄花苷和总黄酮等活性成分质量分数。本研究结果表明，在试验因素范围内氮、磷、钾均有利于瓦布贝母增重率的提高和总生物碱的积累。试验中测得的总生物碱质量分数高于张培培等[17]的测定结果，说明氮磷钾配施可以提高瓦布贝母总生物碱的质量分数。

大量研究表明氮肥对产量的影响较大[30-32]，本试验中磷肥对瓦布贝母产量的影响较大，原因可能是氮肥用量较少，增加用量影响较小；磷可以促进根系的生长发育。氮肥对生物碱的积累影响较大，可能是因为氮元素是生物碱的组成元素之一，张燕等[33]的研究结果也说明氮对生物碱的合成有促进作用，但对其作用机制还未有更深入的研究。由互作效应得到的两因素互作效应可知磷钾互作影响增重率，氮钾互作影响瓦布贝母总生物碱的质量分数积累。磷钾均可以影响植物的生长发育，钾的作用只有在磷充足的条件下发挥出来[34]，钾可以提高氮肥的效应。

通过二次通用旋转试验设计，本研究建立氮肥、磷肥、钾肥与瓦布贝母鳞茎增重率和总生物碱之间的回归方程。试验模型结果表明，氮磷钾肥配施有利于瓦布贝母增重率和总生物碱质量分数的提高，但是需要适量施用，过量施用会对产量、总生物碱质量分数产生抑制效果。综合考虑产量与质量可以得出施用氮肥8.98～12.00 kg/hm2、磷肥 38.79～43.37kg/hm2、钾肥17.44～24.49 kg/hm2时，可使瓦布贝母增重率大于105.13%，总生物碱质量分数大于0.37%。