香丹注射液内毒素检查法的可行性研究

王继兵 陈 君

（1 湖北省襄阳市谷城县庙滩中心卫生院，湖北 襄阳 441721；2 湖北省襄阳市食品药品检验所，湖北 襄阳 441021）

香丹注射液收录在卫生部药品标准中药成方制剂十七册，是由丹参和降香2味中草药制成，为棕色的澄明液体。有扩张血管，冠状动脉血流量的功效，临床静脉滴注用于心绞痛，亦可用于心肌梗死。由于其疗效显著，价格低廉，在临床上使用非常普遍。目前该药仍沿用家兔法检测热原，家兔法操作繁琐、费时、成本高，灵敏度低，我们现根据2015年版药典四部细菌内毒素检查法和热原家兔法的要求[1]，对该药进行了检测研究对比，结果表明，香丹注射液可以用细菌内毒素检查法代替家兔法检测热原，但是应考虑到药物对试验的干扰。

1 仪器与材料

1.1 仪器：旋涡式混悬器（天津药典标准仪器厂，ZH-2型）；电热恒温水浴箱（江苏金坛市中大仪器厂，420型）；无热源移液器（上海求精生化试剂仪器有限公司）。

1.2 材料：鲎试剂2个规格，各2批（湛江安度斯生物有限公司，灵敏度0.5 Eu/mL，批号1504152，批号1608291，灵敏度0.25 Eu/mL，批号1612091，批号1703151），细菌内毒素检测用水（湛江安度斯生物有限公司，规格5.0 mL，批号1506080），细菌内毒素工作标准品（湛江安度斯生物有限公司，规格10EU/支，批号1507080）。热原用家兔，健康并经预测合格，香丹注射液（国药集团宜宾制药有限责任公司，批号17070214、17090314）

2 结 果

2.1 内毒素限值的确定：按中国药典2015年版4部1143规定，药品、生物制品细菌内毒素限值（L）按以下公式确定：L=K/M，K为人每千克体质量每小时最大可接受的内毒素计量，注射剂K=5EU/（kg·h），M为人用每千克体质量每小时的最大供试品剂量，香丹注射液的用法用量中一次最大注射量为20 mL，药典规定人均体质量按60 kg计算，注射时间按1 h计算，则M=20 mL/（60 kg×1 h）=0.334mL/（kg·h），以此计算出香丹注射液内毒素的限值（L）=5EU/（kg·h）/0.334mL/（kg·h）=15EU/mL。

2.2 确定最大有效稀释倍数MVD：药典规定MVD=cL/λ，其中c为供试品溶液的浓度，这里依据药典，c=1.0 mL/mL，在上一部分我们已经根据香丹注射液的使用说明和药典规定计算出L=15 EU/mL，我们常用的鲎试剂灵敏度为0.5 EU/mL，计算出MVD=cl/λ=30。

2.3 鲎试剂灵敏度复核试验：2015年版药典规定，当使用了新批号的鲎试剂或实验条件发生了任何可能影响检验结果的改变时，应进行鲎试剂灵敏度复核试验。将10EU/支的细菌内毒素国家标准品用细菌内毒素检测用水1.0 mL溶解并在旋涡混合器上混匀15 min后，依法制成2λ、1λ、0.5λ、0.25λ4个浓度的内毒素标准溶液，稀释方法按照如下公式：

每个浓度平行做4支管，再加上两支阴性对照管，每个批次鲎试剂一共18支管，按2015版药典四部操作。经复核，本次试验所用四个批次鲎试剂最大浓度2λ的四支管均为阳性，最小浓度0.25λ的四支管均为阴性，阴性对照管均为阴性，本次实验结果有效，且四个批次鲎试剂λc计算结果均在2λ-0.25λ之间，可用标示灵敏度0.5 EU/mL（0.25 EU/mL）为该批次鲎试剂的灵敏度。

2.4 干扰试验

2.4.1 预实验：将供试品溶液按梯度稀释最大至30倍的5个稀释级的溶液，用标示浓度为0.5 EU/mL的鲎试剂按中国药典2015年版四部1143鲎试剂灵敏度复核试验项下操作，每个浓度平行做4支管，另加2支阴性对照管和2支供试品阴性对照管，2个批次供试品结果相同。标示灵敏度0.5EU/mL批号1504152和批号1608291的鲎试剂结果相同，见表1。

从表1可以看出，本次实验有效，但是该供试品在稀释到30倍时，对含1λ内毒素的鲎试剂有干扰导致结果为阴性，按药典规定，此时可通过对供试品进行更大倍数的稀释来排除干扰，我们只有将其继续往下稀释，此时MVD改变，c和L不变，故λ应为0.25 EU/mL，改用标示灵敏度为0.25 EU/mL的鲎试剂，稀释至最大为60倍的6个稀释级继续重复上述预干扰试验，标示灵敏度为0.25 EU/mL批号1612091和批号1703151的鲎试剂实验结果相同，见表2。

稀释到60倍时，阴性对照管所有平行管都为阴性，2λ管均为阳性，0.25λ管均为阴性，试验有效，1λ管均为阳性，干扰被排除。由此可以得出香丹注射液对内毒素检查法有干扰，稀释60倍可去除干扰。

2.4.2 干扰试验：按照中国药典2015年版四部1143细菌内毒素检查法项下干扰试验表1制备溶液A、B、C、D，试验方法和步骤按按鲎试剂灵敏度复核试验项下[4]。其中供试品溶液为稀释60倍的溶液。见表3。

表3中A和D都为阴性：鲎试剂灵敏度复核结果符合要求：供试品60倍稀释液实验结果复核灵敏度复核实验要求。供试品干扰试验通过。

表2 标示灵敏度为0.25 EU/mL批号1612091和批号1703151的鲎试剂实验结果相同比较

表3 凝胶法干扰试验

2.5 家兔法检测：按中国药典2015年版一部1142热原检查法检验，注射剂量按标准规定为0.5 mL/kg，2批次供试品实验结果如下：第一批次：批号17070214：选取健康并经预测合格试验用家兔3只，体质量分别为2.1 kg、2.2 kg、2.3 kg，注射剂量12.0 mL、11.0 mL、11.5 mL。自兔耳静脉缓缓注射，三只家兔体温升高分别为0.3 ℃、0.4 ℃、0.1 ℃，体温升高总和0.8 ℃。结果符合规定。第二批次：批号17090314：同法操作，三只家兔体温升高分别为0.2 ℃、0.1 ℃、0.0 ℃，体温升高总和0.3 ℃。结果符合规定。本次实验2批次供试品热原试验符合规定。

2.5 供试品用细菌内毒素检查法与家兔法检测结果比较：本次实验2批次供试品稀释60倍，参照2015年版药典四部1143细菌内毒素检查法，用0.25EU/支的鲎试剂检验，结果均为阴性。按照2015年版药典四部1142热原检查法进行检测，结果也均符合规定，两种方法结果完全一致。

3 讨 论

香丹注射液为中成药制剂，为临床常用药品，目前仍采用家兔法检测热原，费时费力，且成本高。大家都在检讨对它改成进行细菌内毒素检查法，但是在实验中应考虑到药品本身对试剂的干扰，经论证，实验中应用0.25 EU/mL的鲎试剂检验的采用供试品60倍稀释液对样品进行检测以去除干扰。