响应面法优化壳聚糖对三七茎叶皂苷提取液除杂工艺的影响

秦 枫,朱善元,李金贵,辛雪梅,王安平,吴 双

(1.扬州大学 兽医学院,江苏 扬州 225009; 2.江苏农牧科技职业学院/江苏省兽用生物制药高技术研究重点实验室,江苏 泰州 225300)

三七(Panaxnotoginseng)茎叶主要用于化瘀消肿、镇痛止血等,在我国云南及东南亚国家有将其作为茶饮料及食用的习惯,亦可做成药膳用以保健、养生[1-3]。三七茎叶主要成分为皂苷,含有人参皂苷Rb3、C-Mx1、Rc、Rb1及三七皂苷R1、Fa等几十种皂苷[4-5]。GUO等[6]从三七茎叶中分离得到了54个组分,其中，25个组分中富含皂苷。皂苷具有治疗酒精肝[7]、肥胖症[8]及抑制芳香化酶活性[9]等作用,对心脑血管疾病的治疗效果显著。

三七茎叶作为三七的非药用部位,价格低廉,常被作为废弃物处理,若研究其提取工艺,并对其进行综合开发利用,可变废为宝。在三七茎叶皂苷分离过程中发现,茎叶中所含淀粉、蛋白质等物质会对活性成分分离带来很大困扰,一般提取工艺多采用水煎醇沉法除去蛋白质等杂质,但要消耗大量乙醇,不仅成本高,而且费时费力,还会造成有效成分流失。壳聚糖是天然阳离子型絮凝剂,具有优良的絮凝效果。目前,虽有一些壳聚糖澄清三七茎叶水煎液的相关报道[10],但其考察因素较少,试验设计比较简单。与正交设计相比,响应面法可以设计非线性模型,创建二次回归方程,具有试验设计更全面、预测精度更高的优点。鉴于此,本研究采用响应面法优化壳聚糖用于三七茎叶皂苷提取液除杂工艺,为三七茎叶皂苷进一步开发利用提供依据。

1 材料和方法

1.1 试验用药物

三七茎叶、壳聚糖、香草醛等均购自扬州科能生物科技有限公司。

1.2 试验方法

1.2.1 三七茎叶皂苷提取液制备 称取三七茎叶200 g,置于烧杯中,以10倍的蒸馏水加热回流提取3次。第1次加热回流2 h,第2、3次加热回流各1.5 h。每次以绸布趁热过滤掉残渣,合并提取液,浓缩,定容至500 mL,即为三七茎叶皂苷提取液。此时,药液质量体积比[生药质量(g)∶提取液体积(mL)]为1∶2.5。

1.2.2 壳聚糖溶液制备 称取壳聚糖 10.0 g,先以少量l%醋酸搅拌至糊状,再定容至1 000 mL。溶胀24 h以上,搅拌均匀,即为1%壳聚糖溶液,备用[11]。

1.2.3 皂苷对照品溶液配制与标准曲线制备 将三七皂苷Rg1标准品在60 ℃下干燥至恒质量,取2.51 mg置于容量瓶中,以甲醇溶解,定容至25 mL,摇匀,得对照品溶液,质量浓度为0.100 4 mg/mL。参照文献[12]的方法,采用香草醛-高氯酸法测定皂苷质量浓度,并制备标准曲线[12]。

1.2.4 固形物去除率测定 精密量取澄清前、澄清后的提取液各15 mL,放在已经干燥处理好的蒸发皿中,置于105 ℃电热恒温鼓风干燥箱中烘干3 h,之后置于37 ℃恒温干燥箱中冷却30 min,快速称质量,计算固形物去除率(E1)。E1=(澄清前固形物质量-澄清后固形物质量)/澄清前固形物质量×100%。

1.2.5 皂苷保留率测定 分别取澄清前、澄清后的提取液,按照1.2.3中的方法进行皂苷保留率测定(E2)。E2=澄清后皂苷质量/澄清前皂苷质量×100%。

1.2.6 综合评分计算 提取液中加入澄清剂进行除杂,不仅需要最大限度地减少皂苷有效成分的损失,还要保证良好的澄清效果,因此,同时选择E1和E2作为评价性指标进行综合评分。将E1的权重设定为0.3,E2的权重设定为0.7,按下列公式计算综合评分(OD)。OD=E1/E1max×0.3+E2/E2max×0.7[13]。

1.3 除杂工艺单因素考察

1.3.1 药液质量体积比对除杂效果影响 按单因素设计试验,分别以A、B、C、D代表药液质量体积比、壳聚糖用量、作用温度、搅拌时间。固定B为0.8 mL/g,取适量三七茎叶皂苷提取液原液,分别稀释成药液质量体积比为1∶5、1∶6、1∶8、1∶10的提取液,每份20 mL,在50 ℃条件下加入壳聚糖溶液,充分搅拌20 min,置于水浴锅中50 ℃保温1 h。之后,在室温下静置12 h,离心,过滤,定容至25 mL,测定E1以及E2。

1.3.2 壳聚糖用量、作用温度、搅拌时间考察 设定A为1∶6、C为50 ℃、D为20 min,考察B分别为0.6、0.8、1.0、1.2、1.4、1.6 mL/g时对E1、E2和OD的影响；设定A为1∶6、B为0.8 mL/g、D为20 min,考察C分别为40、50、60、70、80 ℃ 时对E1、E2和OD的影响；设定A为1∶6、B为0.8 mL/g、C为50 ℃,考察D分别为10、20、30、40、60 min时对E1、E2和OD的影响。

1.4 响应面法优化方法设计

在单因素试验的基础上,根据Design-Expert 8.0.6设计原理,将A、B、C作为自变量,进行试验因素和水平设计,详见表1。

表1 响应面法优化壳聚糖对三七茎叶皂苷提取液除杂工艺的分析因素和水平Tab.1 Factors and levels of response surface methodology to the purifying technology of the saponin extract of leaves and stems of Panax notoginseng with chitosan

2 结果与分析

2.1 响应面法优化壳聚糖对三七茎叶皂苷提取液除杂工艺标准曲线方程

建立标准曲线方程：y=0.369 5x-0.070 9,R=0.993 8。其中,y为吸光度,x为标准品质量浓度。结合1.2.3可知,x介于0.008 37～0.050 20 mg/mL,存在良好线性关系。

2.2 响应面法优化壳聚糖对三七茎叶皂苷提取液除杂工艺单因素试验结果与分析

A、B、C、D对壳聚糖除杂效果的影响见表2—5。随着A的降低,OD值呈现增大的趋势。B为0.8、1.4、1.6 mL/g时，OD值比较大。随着C的增加,OD值出现先增大后降低的趋势。D达到20 min之后,不同搅拌时间对OD值的影响无明显规律，且OD值较小。综上,认为A、B、C对OD值的影响较大。结合提取效率及工业生产的需要,将A设为1∶5、1∶6、1∶7,共3个水平,将B、C分别设为1.0 mL/g、60 ℃,建立模型。

表2 药液质量体积比对三七茎叶皂苷提取液除杂效果的影响Tab.2 Effect of mass-volume ratio of medicine to extract liquid on the purification of the saponin extract of leaves and stems of Panax notoginseng

表3 壳聚糖用量对三七茎叶皂苷提取液除杂效果的影响Tab.3 Effect of chitosan dosage on the purification of the saponin extract of leaves and stems of Panax notoginseng

表4 作用温度对三七茎叶皂苷提取液除杂效果的影响Tab.4 Effect of acting temperature on the purification of the saponin extract of leaves and stems of Panax notoginseng

表5 搅拌时间对三七茎叶皂苷提取液除杂效果的影响Tab.5 Effect of stirring time on the purification of the saponin extract of leaves and stems of Panax notoginseng

2.3 响应面法优化壳聚糖对三七茎叶皂苷提取液除杂工艺试验与分析

2.3.1 响应面法优化壳聚糖对三七茎叶皂苷提取液除杂工艺模型的建立及方差分析 以A、B、C为考察因素,以 OD 作为评价指标,按照三因素三水平的响应面分析方法进行试验。每个因素按1.4中的方法设置3个水平,试验按1.3.1中的方法进行,响应面分析方案及结果见表6,方差分析结果见表7。将所得数据以Design-Expert 8.0.6 软件进行分析,得响应值(Y)对编码自变量的二次多项回归方程：Y=81.32-1.77A-2.35B+17.69C+0.60AB+0.30AC-1.14BC-2.69A2+1.11B2-17.53C2。

对该模型进行方差分析和显著性检验。由表7可得,模型的F值为8.96,P=0.004 3。P<0.01,表明达到极显著水平。模型的确定系数为0.817 5,说明方程的因变量与全体自变量间线性关系显著,响应值的变化有81.75%来源于所选自变量。同时,模型失拟项F值为0.28,P>0.05,可知失拟项不显著,表明该方程试验误差小,拟合较好。由此可知,拟合的回归方程良好,故可用回归模型代替试验真实点对试验结果进行分析。对响应值影响显著的因素是C和C2,AB、AC、BC不显著,说明温度对响应值的影响较大,各因素之间无明显交互作用。

2.3.2 响应面法优化壳聚糖对三七茎叶皂苷提取液除杂工艺的等高线及响应面结果与分析 根据二次多项回归方程,分别固定因素C,取值 50 ℃；固定因素B,取中间值1.0 mL/g；固定因素A,取中间值1∶6,作AB、AC、BC之间的等高线图和响应面图(图1)。

表6 响应面法优化壳聚糖对三七茎叶皂苷提取液的除杂工艺试验设计与结果Tab.6 Design and results of response surface methodology to the purifying technology of the saponin extract of leaves and stems of Panax notoginseng with chitosan

表7 响应面法优化壳聚糖对三七茎叶皂苷提取液的除杂工艺方差分析Tab.7 Analysis of variance in response surface methodology to the purifying technology of the saponin extract of leaves and stems of Panax notoginseng with chitosan

注：**为极显著(P<0.01)。

Note: ** was extremely significant (P<0.01).

响应面的陡峭程度反映了不同试验因素对结果的影响程度,响应面越陡峭,说明该因素对试验结果影响越大。反之,则对试验结果影响越小。由图1a1可知,AB之间作用平缓。由图1b1、1c1可知,固定A、B其中任何1个因素,其OD值均随着因素C的增高而呈现先增高后降低的趋势,但响应面变化比较平缓,说明3个因素之间不存在交互作用,其中,因素C对结果影响极显著。

2.4 响应面法优化的壳聚糖对三七茎叶皂苷提取液除杂最佳提取工艺条件

由Design-Expert 8.0.6软件进行岭脊分析,用回归模型进行预测,得出最佳工艺条件,其中,A为1∶6.25,B为0.80 mL/g,C为65.34 ℃。根据实际工艺条件操作的可行性和简易性,修正了各工艺条件,其中,A为1∶6,B为 0.80 mL/g,C为 65 ℃。为了解预测结果的重现性,在此工艺条件下进行三七茎叶皂苷提取液除杂工艺的验证,重复3次试验,结果见表8。E1为26.09%,E2为96.10%,其RSD分别为1.54%、0.69%,表明该模型有效,该方程能够客观地反映各因素对三七茎叶皂苷提取液除杂效果的影响。

a1、b1、c1：响应面；a2、b2、c2：响应面对应的等高线a1,b1,c1: Response surface; a2,b2,c2: Contour corresponding to response surface图1 各试验因素对三七茎叶皂苷提取液除杂效果的影响Fig.1 Effects of experimental factors on the purification of the saponin extract of leaves and stems of Panax notoginseng

表8 响应面法优化壳聚糖对三七茎叶皂苷提取液的除杂工艺验证试验结果Tab.8 Verification test results of the purifying technology of the saponin extract of leaves and stems of Panax notoginseng with chitosan

3 结论与讨论

本研究采用的响应面法是由BOX等[14]提出的试验设计方法,其将试验设计和数学建模进行优化,回归拟合整体因素与结果的函数关系,取得各因素最优水平值[15]。该方法具有试验周期短、试验次数少、精密度高等优点,已经广泛应用于农业、制药、化工等领域[16-18]。正交试验不能在获得因素和响应值之间找到明确的函数表达式,无法获得最优方案和最优值,而且水平数较多时,试验次数多,实施比较困难。本研究以三七茎叶为原料,采用壳聚糖除杂工艺,在单因素试验基础上,利用 Design-Expert 8.0.6软件,通过响应面法对三七茎叶壳聚糖除杂工艺进行了优化,得出最佳工艺条件,其中,A为1∶6,B为 0.80 mL/g,C为 65 ℃。回归分析表明,该回归模型具有较高的准确性和可信度,可用于三七茎叶皂苷提取液壳聚糖除杂的预测与分析。

关于三七茎叶的提取除杂已有相关的报道,潘育方等[10]应用澄清剂壳聚糖,对三七茎叶粗粉的煎煮液进行澄清条件试验,得到最佳工艺：在室温下,将壳聚糖(用量为0.075 g/100 mL)加入三七水提液中进行絮凝。张志信等[19]应用明胶,以黄酮质量浓度为指标,对三七茎叶水提取液进行澄清条件试验,得到最佳提取工艺：澄清剂的添加量为提取液体积的0.9%,静置2 d,pH值调节为6,温度为室温。李维莉等[20]采用酸水提取法提取三七叶苷,以膜-树脂联用技术分离纯化三七叶苷,对纯化的几种方法如自然沉降法、水煎醇沉法、ZTC 1+ 1Ⅱ型天然澄清剂法、无机陶瓷膜微滤法、无机陶瓷膜-树脂法进行考察。结果表明,采用无机陶瓷膜分离与HPD 100大孔吸附树脂联用技术效果较好。从除杂率来看,上述各种方法都有纯化作用,以膜-树脂法为最高,达80%以上。从损失率看,水煎醇沉法的损失率最高,在30%左右。上述研究报道均未通过相关试验建立模型并进行验证,其研究的工艺是否最佳缺乏充分依据。虽然均以澄清度、除杂率或有效成分质量浓度为检测指标,但均未采用综合评分作为考查指标,结果判定缺乏周密性。虽然膜分离方法取得了较好的效果,但滤膜抗污染能力弱,使用寿命短,不适用于工业化生产。本研究采用响应面法设计优化试验条件,使皂苷保留率大于96%,固形物去除率高于20%,优于上述大部分研究。

综上所述,按照本研究所建立模型最佳工艺进行试验,固形物去除率和皂苷保留率均较高,且RSD较小,重现性较好,证明了该模型切实有效。此模型的建立,可为三七茎叶皂苷的提取精制及工业化生产提供一定的参考,为三七茎叶的进一步开发利用提供依据。