基于整体材料的固相萃取与毛细管电泳技术联合分离检测桑叶中的多酚类物质

李晓慧,徐志辉,李利军,程 昊,冯 军,3*

(1.广西科技大学 生物与化学工程学院,广西糖资源绿色加工重点实验室,广西 柳州 545006；2.广西科技大学医学院,广西 柳州 545005；3.蔗糖产业省部共建协同创新中心，广西 南宁 530004)

桑叶为桑科植物桑树的叶，既是食品又是药品，桑叶味甘、苦，性寒，具有润燥清肺、疏风散热、养肝明目等功效[1]。桑叶含有多种多酚类物质，如芦丁[2]、绿原酸[3]、槲皮素[4]等。多酚类物质是植物中重要的次级代谢产物，具有抗氧化、清除自由基、预防心血管疾病、抗癌、抗炎症和抗血小板凝聚等功能[5-7]。因此，对桑叶中多酚类物质进行质量控制与分离分析具有重要现实意义。但由于桑叶的多酚类物质含量较低，且组成复杂，结构不稳定，易氧化分解[8]，与生物碱、多糖等生物大分子可发生结合[9]，还能与蛋白质通过共价键发生不可逆结合[10]，干扰较多。因此，对桑叶样品的预处理尤其重要[11]。目前，桑叶中多酚类物质的分离检测主要有高效液相色谱法(HPLC)[12-14]、毛细管电泳法(CE)[15]等。其中，HPLC分析多酚类物质多采用梯度洗脱，但分析时间较长且耗费有机试剂[16]；苑广信等[15]采用CE法分离测定桑叶中的多酚类物质，分析虽较为快速，待测绿原酸也基本达到基线分离，但由于样品基底复杂引起的基线抬高以及紧随绿原酸之后的杂质峰会一定程度上影响待测物质的准确定量。

固相萃取是近年发展起来的一种新型预处理技术，具有除杂、富集、操作简单等优点[17]。已有报道采用固相萃取预处理方式对植物多酚类物质进行分离分析[18]，但其采用C18填充柱为固相萃取柱，预处理过程略复杂。此外，C18填充柱制备过程复杂，需要丰富的填柱经验和娴熟的烧塞技术，且为一次性使用，成本较高[19]。与C18填充柱相比，聚合物整体柱(Monolithic column)采用原位热聚合的方式制备，无需特殊填充设备，具有制备过程简单、内部结构均匀、通透性和重现性好、成本低廉，且可根据待测样品的性质选择不同功能的单体等优点[20-22]，是分离科学领域的新发展方向，目前已在生物、医药、食品等领域得到广泛应用[23-24]。

本文以甲基丙烯酸丁酯(BMA)为单体,乙二醇二甲基丙烯酸酯(EDMA)为交联剂，正丙醇、1,4-丁二醇为致孔剂，偶氮二异丁腈(AIBN)为引发剂，采用热聚合方式合成了poly(BMA-co-EDMA)整体柱，并考察了单体与致孔剂用量对整体柱制备的影响。同时，以该整体柱作为固相萃取柱，与毛细管电泳联用，建立了桑叶中多酚类物质富集、纯化、分离分析的方法，并对影响固相萃取的多种因素进行了考察。相比于纯CE法，本方法进一步缩短了分析周期(仅需8 min左右)，预处理过程简单，基线平直，具有更宽的线性范围，定量分析也更为准确。

1 实验部分

1.1 仪器与试剂

Agilent 7100毛细管电泳系统(美国Agilent公司)；Frontier傅立叶红外光谱仪(美国Perkin Elmer公司)；Hitachi S-4800冷场发射扫描电子显微镜(日本日立公司)；旋转蒸发仪(上海亚荣生化仪器厂)；优普UPH-IV-20T纯水/超纯水机(四川优普超纯科技有限公司)。

甲基丙烯酸丁酯(BMA)、乙二醇二甲基丙烯酸酯(EDMA)、偶氮二异丁腈(AIBN)、3-(异丁烯酰氧)丙基三甲氧基硅烷(γ-MAPS)、甲基三甲氧基硅烷(MTMS)、芦丁对照品、绿原酸对照品、槲皮素对照品(上海阿拉丁试剂有限公司)；正丙醇、乙醚、十水合四硼酸钠、无水乙醇(四川西陇化工股份有限公司)；1，4-丁二醇(上海麦克林生化科技有限公司)；甲醇(广东光华科技股份有限公司);乙腈(天津市科密欧化学试剂有限公司)；十二烷基硫酸钠(化学纯，国药集团化学试剂有限公司)。所有试剂未特殊说明，均为分析纯。实验用水均为超纯水，桑叶产自安徽亳州。

1.2 标准溶液的配制

精密称取芦丁、绿原酸、槲皮素对照品各25.00 mg，用甲醇溶解，定容至25 mL容量瓶中，摇匀，即得1 mg/mL对照溶液，按照梯度稀释至质量浓度分别为10、 20、40、80、160 μg/mL的工作对照品。以上所有对照品溶液均在4 ℃下避光保存。

1.3 样品的制备

称取干燥桑叶粉末1.000 g置于索氏提取器中，用150 mL乙醚连续脱脂8 h，之后在室温下冷却10 min，使残余的乙醚挥发完全。将得到的粉末倒入100 mL烧杯中并加入30 mL甲醇，封口超声30 min，连续提取2次后，合并2次滤液，置于旋转蒸发器中挥发去甲醇，用25%乙醇定容至50 mL容量瓶中，检测前经0.45 μm滤膜过滤。

1.4 poly(BMA-co-EDMA)整体柱的制备

将单体BMA、交联剂EDMA、引发剂AIBN、致孔剂正丙醇和1，4-丁二醇按照表1所示配比，在室温下超声20 min混合均匀，通氮气10 min 除去氧气，取预聚液至200 μL移液枪头(使用前，用体积比为6∶1的MTMS-50%γ-MAPS对移液枪头内表面进行硅烷化修饰)中，两端封口，置于60 ℃水浴中恒温，反应20 h。反应结束后，分别以甲醇和水冲洗固相萃取柱，除去未反应的单体和致孔剂，然后置于60 ℃恒温干燥箱中干燥至恒重，得到poly(BMA-co-EDMA)整体柱，密封保存备用。同时，在移液枪头外，以同样的比例平行制备整体柱材料，用于SEM表征。

表1 不同组成的聚合物溶液制备的poly(BMA-co-EDMA)整体柱Table 1 Different composition of polymer solution for preparation of poly(BMA-co-EDMA) monolithic column

1.5 固相萃取方法

将制备的整体柱安装在5 mL注射器上，用5 mL甲醇以0.5 mL/min流速活化poly(BMA-co-EDMA)固相萃取柱后，取2 mL提取液移至固相萃取柱，用0.5 mL pH 3.0磷酸缓冲液进行预洗脱，再以0.5 mL乙腈作为洗脱液对目标物进行洗脱，收集洗脱液，氮气吹干后，用甲醇溶解，0.45 μm滤膜过滤，待测。

1.6 毛细管电泳条件

Agilent高效毛细管电泳熔融石英毛细管(总长度65 cm,有效长度56 cm,内径75 μm)，电泳缓冲溶液为15 mmol/L pH 8.5硼砂溶液(含5 mmol/L十二烷基硫酸钠)、分离高压20 kV，紫外检测波长210 nm。

图1 BMA单体(a)及poly(BMA-co-EDMA)整体柱(b)的红外光谱Fig.1 Infrared spectra of BMA monomer(a)and poly(BMA-co-EDMA) monolithic column(b)

图2 单体与致孔剂比例为30∶70的整体柱SEM图Fig.2 SEM image of monolithic column with monomer to porogen ratio of 30∶70

2 结果与讨论

2.1 poly(BMA-co-EDMA)整体柱的表征

2.2 poly(BMA-co-EDMA)整体柱聚合条件的优化

整体柱的渗透性、稳定性、重复性等性质受到聚合反应中各组分比例的影响。为了制备内部结构与孔径均匀、柱通透性良好、柱效高的poly(BMA-co-EDMA)整体柱，考察了单体及致孔剂之间的比例对整体柱萃取效率的影响。

图3 不同单体与致孔剂比例整体柱萃取后的电泳谱图Fig.3 Electropherograms of different ratios 0.5 of monomer to porogen after monolithic column extraction

2.2.1 单体与致孔剂比例的优化单体与致孔剂的比例直接影响整体柱的制备，当单体比例减小、致孔剂比例增大时，聚合物的孔径和粒径增大，结构疏松，硬度降低。如表1中A1～C2所示，本实验考察了单体与致孔剂的质量比分别为40∶60、30∶70、20∶80时，制备的poly(BMA-co-EDMA)整体柱的SEM图。结果显示，当致孔剂含量为70%时，整体柱的硬度合适，孔径均匀，疏松多孔(图2)。从图3中可以看出，芦丁、绿原酸、槲皮素经比例为40∶60整体柱固相萃取后，杂质峰仍较多，未完全达到除杂效果。经比例为20∶80整体柱固相萃取后，待测样品未能很好保留。而经比例为30∶70整体柱固相萃取后，芦丁、绿原酸、槲皮素均有较好的保留，且能达到充分除杂的目的。因此，实验选取单体与致孔剂的比例为30∶70的整体柱。

图4 正丙醇与1,4-丁二醇比例为76∶24的整体柱SEM图Fig.4 SEM image of a monolithic column with a ratio of n-propanol to 1,4-butanediol of 76∶24

2.2.2 致孔剂比例的优化在单体与致孔剂的比例为30∶70基础上，进一步优化致孔剂中不同正丙醇与1,4-丁二醇比例(70∶30、76∶24、80∶20，即表1 D、E、F组)对制备poly(BMA-co-EDMA)整体柱的影响。结果显示，当正丙醇的比例增大，1,4-丁二醇的比例减小时，聚合物的孔径会增大。当正丙醇与1,4-丁二醇的比例为76∶24时，聚合物整体柱的孔径及颗粒大小均匀(图4)。最终确定单体与致孔剂的比例为30∶70，致孔剂正丙醇与1,4-丁二醇的比例为76∶24制备整体柱(表1 E组)。

2.3 poly(BMA-co-EDMA)整体柱固相萃取条件的优化

通常多酚类物质的预处理主要采用C18固相萃取柱，由于多酚类物质具有一定的极性，本实验制备的poly(BMA-co-EDMA)整体柱骨架表面的丁基具有疏水性，可用于固相萃取桑叶中的多酚类物质。为了获得最佳的萃取率，实验考察了淋洗液种类、淋洗液流速和体积、洗脱液种类对萃取效率的影响。

2.3.1 淋洗液的选择选择合适的淋洗液对样品进行预洗脱，不仅能除去保留在固相萃取柱上的干扰物，而且不会对目标物产生影响。取制备好的固相萃取整体柱，按照“1.5”方法进行预处理，考察了pH 3.0磷酸盐缓冲液和15%甲醇溶液的预洗脱能力。结果显示，虽然15%甲醇的除杂效果较好，但会同时将部分待测组分洗脱，从而导致待测组分的浓度变低，峰面积变小，富集效果变弱；而pH 3.0磷酸盐缓冲液在去除杂质的同时最大程度地保留了待测组分。因此本实验最终选择pH 3.0磷酸盐缓冲液作为淋洗液。

图5 不同洗脱液的电泳谱图Fig.5 Electropherograms of different eluentsa.extracts of mulberry leaf;b.methanol;c.acetonitrile；1.rutin，2.chlorogenic acid,3.quercetin

2.3.2 洗脱液的选择根据多酚类物质与整体柱的极性差异，本实验对甲醇和乙腈的洗脱能力进行了考察。与未经整体柱固相萃取的提取原液相比(图5a)，在采用甲醇作为洗脱液时，有较好的洗脱能力，能够除去大部分杂质并保留桑叶中3种多酚类物质，且对多酚具有富集能力，但仍存在少许杂质对3种待测多酚类物质产生干扰(图5b)。而采用乙腈作为洗脱液时，基本能够除去所有干扰杂质且只对桑叶多酚进行保留吸附，峰形较好(图5c)。综合考虑，采用乙腈作为多酚类物质的洗脱溶液。

2.3.3 淋洗液流速与体积的优化淋洗液的流速及流量是影响桑叶多酚的吸附效率及除杂效果的重要参数之一。当流速过快与流量过大时，会造成桑叶多酚吸附率的降低，且很容易冲断整体柱；而流速过慢及流量过小时，达不到很好的除杂效果。为了获得更好的除杂效率,最终决定淋洗液以流速0.1 mL/min，体积0.5 mL进行预洗脱除杂。

综上所述，poly(BMA-co-EDMA)整体柱的最优萃取条件为：淋洗液为pH 3.0磷酸盐缓冲液，淋洗流速为0.1 mL/min，体积为0.5 mL；洗脱液为乙腈。

2.4 方法验证

2.4.1 线性关系与检出限取“1.2”配制好的浓度分别为10、20、40、80、160 μg/mL的芦丁、绿原酸、槲皮素对照品溶液，按“1.6 ”毛细管电泳条件进行分析，以质量浓度为横坐标，峰面积为纵坐标绘制标准曲线。结果显示，芦丁、绿原酸、槲皮素在10～160 μg/mL范围内线性关系良好，相关系数(r)分别为0.995 5、0.998 5、0.999 5，检出限(LOD，S/N=3)分别为4.65、1.12、3.49 μg/mL。

2.4.2 精密度分别取50 μg/mL的芦丁、绿原酸、槲皮素对照品溶液，连续进样6次，结果显示，芦丁、绿原酸、槲皮素的相对标准偏差(RSD)分别为2.4%、0.98%、2.8%。表明仪器的精密度良好。

图6 经整体柱固相萃取前(a)后(b)样品的电泳谱图Fig.6 Electropherograms of before(a) and after(b) monolithic column extraction

2.4.3 实际样品分析将桑叶提取物按照“1.5”方法，用poly(BMA-co-EDMA)整体柱萃取，在最优毛细管电泳条件下进行分离测定，将未萃取样品(图6a)与经过整体柱固相萃取后的样品(图6b)进行比较，芦丁、绿原酸、槲皮素得到明显富集、纯化，杂质峰明显减少，说明poly(BMA-co-EDMA)整体柱对桑叶中的多酚类物质有较好的富集、纯化作用。

将经过固相萃取的样品溶液连续进样3次，取峰面积平均值计算，进行实际样品测定。最终测得桑叶中芦丁、绿原酸、槲皮素的含量分别为37.12、60.20、21.49 μg/mL(见表2)。

2.4.4 回收率与相对标准偏差对经过预处理的样品中的芦丁、绿原酸、槲皮素进行加标回收率测定，加标浓度分别为10、40、60 μg/mL，测得结果如表2所示。芦丁、绿原酸、槲皮素的回收率为94.7%～102%，RSD为1.2%～3.4%，表明该方法具有较好的准确度和重现性，适合于桑叶中多酚类物质的分离检测。

3 结 论

本文使用原位聚合法制备了固相萃取整体柱，并与毛细管电泳联用，建立了整体柱固相萃取-毛细管电泳联用分析桑叶中芦丁、绿原酸、槲皮素的方法。与C18填充柱存在的制备复杂、成本过高的固有缺点相比，该整体柱制备简单，通透性好，预处理简便，柱效高，可重复多次使用，能有效萃取桑叶中的芦丁、绿原酸、槲皮素。所建方法的线性范围为10～160 μg/mL，检出限为1.12～4.65 μg/mL，加标回收率为94.7%～102%，RSD为1.2%～3.4%。该方法简单、高效、成本低，可用于桑叶中芦丁、绿原酸、槲皮素的分离检测。