高效液相色谱和超高效液相色谱法测定乳制品中三聚氰胺含量的对比

1 引言

三聚氰胺(英文名Melamine)，简称三胺，又名蜜胺、氰尿酰胺。分子式C3N3H6,分子量126.12。白色结晶粉末，无味，相对密度1570kg/m3。微溶于水（3.1g/L常温），可溶于甲醇、甲醛、乙酸、热乙二醇、甘油、吡啶等，不溶于丙酮、醚类、对身体有害，不可用于食品加工或食品添加物。[1,2]

但由于目前食品检测中测定蛋白质的凯氏定氮法是通过测定样品中氮原子含量来间接推算出蛋白质含量的，而此方法无法识别氮的来源，蛋白质的平均含氮量为16%，而是三聚氰胺含氮量高达66.67%，少量添加即可大大提高产品的含氮量，不法商人借此提升食品检测蛋白质含量指标，从而通过检验机构的检测[3]。

而对于三聚氰胺的测定方法有很多，例如液相色谱法、气相色谱-质谱法、毛细管电泳法、分光光度法、酶联免疫法（ELISA）等，其中毛细管电泳法和分光光度法灵敏度低，只可满足一般检测要求；气相色谱-质谱法需要衍生化步骤，操作繁琐；ELISA则只适用于大批样快速筛选检测，若为阳性需进一步确证[4]。而液相色谱法为国标中乳与乳制品检测的推荐方法，可定性定量[5]，但普通液相色谱法仍有测定样品周期长，产生废液量大的缺点，故本文对原有HPLC方法进行转化并优化，建立超高效液相色谱（UPLC）法，为乳制品中三聚氰胺含量的测定提供更快速、高效、灵敏和环保的方法。

2 材料

2.1 仪器

岛津LC_20AB型高效液相色谱仪（日本 岛津）；Waters Acquity UPLC 超高效液相色谱仪(美国 沃特世)；AG285 型天平(瑞士 梅特勒)；超纯水仪(美国 密理博）。

2.2 试剂

三聚氰胺对照品（CAS 108-78-01,纯度大于99.0%）、甲醇（色谱纯）、乙腈（色谱纯）、辛烷磺酸钠（色谱纯）、超纯水。

3 方法与结果

3.1 色谱条件

3.1.1 HPLC色谱条件：色谱柱为 Agilent Zorbax SB_C18柱（250mm×4.6mm,5μm）;以离子对试剂缓冲溶液（2.10g柠檬酸+2.16g辛烷磺酸钠定容1L,pH为3.0）与乙腈为流动相，V:V=95:5；流速1.0mL/min；柱温40℃；波长240nm；进样量10μL

3.1.2 UPLC色谱条件：色谱柱为 Acquity UPLC BEH C18柱（2.1mm×100mm,1.7μm）;以离子对试剂缓冲溶液（2.10g柠檬酸+2.16g辛烷磺酸钠定容1L,pH为3.0）与乙腈为流动相，V:V=95:5；流速0.5mL/min；柱温40℃；波长240nm；进样量0.5μL。

3.2 对照品溶液的制备

准确称取100mg三聚氰胺标准品于100mL容量瓶，用甲醇水溶液（1:1）溶解并定容至刻度，配制成浓度为1mg/mL的标准储备液，于4℃避光保存。用流动相将三聚氰胺标准储备液逐级稀释得到浓度为0.2、2.0、10.0、20.0、30.0μg/mL的标准工作液，过微孔滤膜后备用。在HPLC条件下三聚氰胺的保留时间为15.12min,在UPLC条件下保留时间为1.12min，见下图。

3.3 供试品溶液的制备

准确称取2g试样于50mL具塞塑料离心管中，加入15mL1%三氯乙酸溶液和5mL乙腈，超声并振荡后，以4000r/min离心10min，上清液过滤后，用三氯乙酸溶液定容至25mL，移取5mL滤液，加入5mL水混匀后转移至固相萃取柱中。依次以3mL水和3mL甲醇洗涤，抽至近干，用6mL氨化甲醇（5%）溶液洗脱。洗脱液于50℃下用氮气吹干，残留物用1mL流动相定容，涡旋混合1min，过微孔滤膜备用。

图1 A HPLC三聚氰胺标准品 B UPLC三聚氰胺标准品）

3.4 方法学考察

3.4.1 线性关系考察

HPLC方法：按“3.1.1”项下色谱条件，浓度由低到高依次进样10.0μL，以峰面积（Y）-浓度（X）作图，得到标准曲线回归方程y=1.69×105+3.07×105 ,r2=0.9989,三聚氰胺在0.2～30μg/mL内呈良好线性关系。

UPLC方法：按“3.1.2”项下色谱条件，浓度由低到高依次进样0.5μL，以峰面积（Y）-浓度（X）作图，得到标准曲线回归方程：y=1.84×103+1.35×103,r2= 0.9999,三聚氰胺在0.2～30μg/mL内呈良好线性关系。

3.4.2 精密度试验

HPLC方法：取“3.2”项下对照品溶液，以10.0μL进样量，连续进样6次，得三聚氰胺保留时间的RSD为15.21min，峰面积的RSD为0.20%，结果表明仪器精密度良好。

UPLC方法：取“3.2”项下对照品溶液，以0.5μL进样量，连续进样6次，得三聚氰胺保留时间的RSD为1.12min，峰面积的RSD为0.16%，结果表明仪器精密度良好。

3.4.3 重复性试验

取浓度为20.0μg/mL的标液，照“3.3”项下的方法制备供试品溶测定三聚氰胺的含量，HPLC和UPLC的RSD分别 0.58%、0.44%。结果表明重复性良好。

3.4.4 稳定性试验

HPLC方法：取“3.3”项下供试品溶液，以10.0μL进样量，分别于0,2,4,8,10，12,24h注入HPLC，得三聚氰胺峰面积的RSD为0.66%，结果表明样品中三聚氰胺在24h内稳定。

UPLC方法：取“3.3”项下供试品溶液，以0.5μL进样量，分别于0,2,4,8,10，12,24h注入UPLC，得三聚氰胺峰面积的RSD为0.54%，结果表明样品中三聚氰胺在24h内稳定。

3.4.5 加标回收试验

取已知浓度的标准系列溶液做加标回收试验，取六个平行样，分别加入定量三聚氰胺对照品，按“3.2”项下方法制备供试品溶液，测定回收率，结果见表1。

3.4.6 样品含量的测定

取不同品牌不同批次的乳制品20批，分别按“3.3”项下方法进行处理，并分别按照HPLC和UPLC色谱检测条件，测定其中三聚氰胺的含量，用外标法计算。结果表明HPLC和UPLC均未检出三聚氰胺，见图2。

图2 C HPLC三聚氰胺样品 D UPLC三聚氰胺样品

4 讨论

本实验通过对比HPLC和UPLC法对乳制品中三聚氰胺含量的测定结果表明，两种方法的精密度、准确性等方面的差异不大，但在灵敏度方面UPLC明显高于HPLC,并且UPLC还具有分析时间短，流动相消耗量低的优点，而在对乳制品的实际检验中，UPLC更能显现出环保、高效的优点，可以在对市面流通乳制品质量的控制中得到广泛应用。

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