枫香速生优良无性系组织培养技术体系

李 勇

（福建省洋口国有林场，福建顺昌 353211）

中国枫香（Liquidambar formosana）生长快，材性好，适应性强，是我国南方林区的主要造林树种之一，广泛分布于南方各省（区）湿润肥沃的立地[1-3]。中国枫香在遗传改良方面已开展了大量工作，已选育出一大批优良品种，如何将优良品种快速繁育推广使用是目前的一个亟待解决的问题[4-10]。苗木的繁育方式主要是有性和无性两种，而枫香需达到一定树龄才能大量结实，仅通过种子繁育实生苗，在时间和数量上难以满足市场需要[11-12]。在无性繁育方面，枫香扦插繁育十分困难[9]，因此，组培成为枫香快速繁育的一种重要途径，开展中国枫香速生优质新品种组培快繁技术研究，有利于快速培育优质新品种。本次试验以福建南平试验点早期选择的优良家系中的优良单株为材料，通过伐桩促萌无性系化，剪切半木质化嫩枝为外植体材料来源，研究枫香优良单株组培快繁技术的诱导、继代增殖、生根、移栽的最合适培养基配方和培养条件，为枫香新品种组培技术提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 试验材料

以福建南平试验点早期选择的枫香为试验材料，采取树高、胸径和材积随机区组重复测量的选优方案，从中优选出9株表型良好、生长量大的优良单株（LFFY-1、LFFY-2、LFFY-3、LFFY-4、LFFY-5、LFFY-6、LFFY-7、 LFFY-8、LFFY-9），其中6年生时树高、胸径和材积的平均值分别可达6.24 m、7.72 cm、0.015 653 m3，平均遗传增益分别为4.47%、4.62%和4.90%。本次试验以枫香LFFY-1、LFFY-2、LFFY-3优良无性系品种的基部萌条作为外植体。

1.2 试验方法

1.2.1 无菌体系建立

先用10%次氯酸钠溶液对茎段消毒50 s，再分别采用70%酒精、0.1升汞进行后续消毒处理。本次试验分别设立的4种不同消毒处理：0.1%升汞12 min；70%酒精10 s+0.1%升汞8 min；70%酒精20 s+0.1%升汞4 min；70%酒精30 s。消毒后，将茎段斜插于无激素MS培养基上进行培养。每瓶接种1个茎段，每处理50瓶，重复5次，每隔2 d对污染瓶进行1次剔除，每隔5 d观察并记录1次外植体污染和萌发情况，40 d后统计萌芽率。

1.2.2 增殖培养

以1/2 MS为基本培养基，按照正交试验L9（34）的设计要求设置试验。试验因素及水平如下：6-BA 0.3～0.9 mg/L， KT 0～1.0 mg/L， IAA 0～1.0 mg/L，附加3.0%蔗糖，pH 5.8。每瓶接种芽苗5个，每处理接种20瓶，重复5次，继代周期30 d，连续继代增殖培养3次后，观察芽苗生长情况，统计增殖倍数。

1.2.3 生根培养

以1/2 MS为基本培养基，L9（34）正交试验的试验因素及水平：茎段长度≤0.5 cm、0.6～1.0 cm、1.1～1.4 cm、 ≥1.5 cm；ABT 10.1 、0.3、0.5、 0.8 mg/L； IBA 0.0、 0.5、 1.0、 1.5 mg/L；NAA 0.0、0.2、0.4、0.6 mg/L。附加3.0%蔗糖，pH 5.8。每种处理重复5次，每个试验组接种30瓶，每瓶10株，生根周期40 d，每10 d观察1次，记录芽苗生长情况，统计生根率。

1.2.4 移栽驯化与后期管理

生根瓶苗经过炼苗后，将瓶苗取出，用清水洗净根部培养基，移栽至用0.1%高锰酸钾溶液灭菌的基质中。本试验以红心土、泥炭土、河砂为组培苗移栽基质，共设置4种处理（表5），每次处理移栽300株，重复5次。移栽后喷淋定根水，覆盖薄膜和遮光度为75%的遮阳网，苗期进行日常管理。移栽30 d后，观察幼苗生长情况并统计移栽成活率。

组培苗移栽后，在覆盖薄膜的条件下封闭培养10 d，棚内温度控制在25～30℃，湿度85%左右。在太阳光强烈的情况下须加盖遮阳网。封闭培养10 d后，掀开薄膜，每天喷水2～3次，保持基质湿润，相对湿度在80%以上。掀开薄膜的同时，采用1 000倍多菌灵或托布津溶液对幼苗及苗床进行灭菌，此后每周用800倍百菌清与1 000倍多菌灵交替喷淋灭菌。移植15 d后进行根外施肥，常用肥料包括0.1%高乐、0.1%叶面营养液等。移栽30 d后每隔10 d淋施水肥1次，通常选用尿素（0.1%）或复合肥（0.1%～0.5%），施肥后用清水洗净叶片残留的肥分。

1.2.5 培养条件

组培苗无菌体系建立、分化和生根培养均在培养室中进行，培养室温度为25～27℃，光照强度为2 500 lx，光照时间为13 h/d。

1.3 数据处理

数据处理采用SPSS 20.0分析。萌动率、增殖倍数、生根率和成活率的计算公式如下：

萌动率（%）=（无感染且有芽点的外植体数/接种外植体总数）×100

增殖倍数=（新增萌芽数/原先接种的继代芽苗总数）×100%

生根率（%）=（萌发根系的芽数/接种芽总数）×100

成活率（%）=（移栽成活的小苗数/移栽小苗总数）×100

2 结果与分析

2.1 灭菌体系的建立

萌动率在不同灭菌处理间有显著差异（P＜0.05）。70%酒精20 s+0.1%升汞4 min的处理萌动率最高（40.5%）；其次是70%酒精10 s+0.1%升汞8 min（31.2%）。仅用0.1%升汞或70%酒精消毒处理下的萌动率稍低，分别为19.7%、23.4%（表1）。

2.2 增殖培养

枫香组培增殖倍数在不同激素种类及浓度组合处理间差异显著（表2）。处理7的增殖倍数最高（1/2 MS+6-BA 0.9 mg/L+IAA 0.5 mg/L），增殖倍数为5.3，有效芽数为4.4个；处理9次之（1/2 MS+6-BA 0.9 mg/L+KT 1.0 mg/L+IAA 0.5 mg/L），增殖倍数为5.0，有效芽数仅2.1个；处理1的增殖倍数和有效芽数均最小，分别为1.9、1.0。对照组CK的增殖倍数为4.7，有效芽数为3.6个。只有当所添加的激素达到了某一适宜浓度和配比才能显著提高增殖倍数。

表1 不同灭菌方式对萌动率的影响Tab.1 Effects of different sterilization methods on germination rates

6-BA使用浓度以第3水平（K3=14.9）最佳，KT使用浓度以第1水平（K1=11.5）最佳，IAA使用浓度以第2水平（K2=12.0）最佳，3个因素作用依次为6-BA＞IAA＞KT（表3）。

表2 不同激素种类及组合对增殖的影响Tab.2 Effects of different hormones and combinations on proliferation

表3 激素处理极差分析结果Tab.3 The range analysis results of hormone treatment

2.3 生根诱导培养

生根率在不同生长素种类及浓度组合间存在显著性差异（P＜0.05）。处理10（ABT 10.3 mg/L+IBA 1.5 mg/L+NAA 0.4 mg/L）的培养基生根率和生根数明显高于其他8种处理，生根率和生根数分别为95.8%和6.1条（表4）。9～16号处理组采用长度大于1.1 cm的继代小芽作为生根材料，生根率均达到70%以上；而采用长度小于1.1 cm的继代小芽进行生根培养，仅有7号处理组的生根率达70%以上，有4个处理组的生根率在60%以下，说明培养材料的选择对枫香的生根诱导影响较大。

表4 不同生长素组合对生根诱导的影响Tab.4 Effects of different auxin combinations on root induction

芽长以第3水平（K3=337.90）最佳，ABT和IBA使用浓度均以第4水平（K4=291.4和K4=329.4）最佳，NAA使用浓度以第3水平（K3=286.4）最佳（表5）。由R值可知，4个因素的作用依次为芽长＞IBA＞ABT＞NAA。

2.4 生根苗移栽

以红心土+泥炭土（1∶1）配比的基质最好，移栽成活率达93%；红心土移栽成活率最低（80%）；红心土与河沙混合的2种处理，移栽成活率分别为85%和86%（表6）。采用红心土移栽成活率较低，可能的原因是红心土过于黏重造成土壤通气透水条件差，在红心土中加入适量泥炭土或河沙，利于改善土壤的通气透水性。

表6 不同基质对生根苗移栽成活率的影响Tab.6 Effects of different mediums on transplanting survival rates of plantlets

3 小结

施季森等[9]、樊靖等[13]、龚峥等[14]分别采用枫香无菌种子萌发后的幼苗下胚轴、5年生单株休眠芽和2年生苗的嫩芽作为试验材料，开展枫香组培快繁试验，均取得了较好的效果。本研究采用早期选择的优良家系中的优良单株不同部位的穗条为试验材料，开展枫香组培试验，得出以下结论：单独使用升汞或酒精对枫香茎段进行消毒处理，虽然可以起到一定消毒效果，但是二者组合处理更有利于提高萌动率，结果表明茎段的最佳灭菌方法为70%酒精20 s+0.1%升汞4 min。在增殖培养过程中，6-BA是影响增殖倍数的主要因素，其次为IAA，以1/2 MS+6-BA 0.9 mg/L+IAA 0.5 mg/L的增殖效果最佳。在生根诱导培养过程中，继代小芽的长度对生根率有显著影响，1.1 cm≤L（芽长）≤1.4 cm的枫香继代小芽更容易生根，生根率高达95.8%。不同移栽基质上的生根苗移栽成活率差异显著，本次试验以红心土+泥炭土（1∶1）混合基质的移栽效果最佳，移栽成活率达93%。