急性胰腺炎大鼠不同病情程度Notch-1信号表达特征探讨

李玉婷，王嘉欣，吴美巧，李璐瑶，樊婷婷，管海飞，王玉香，蔡妍，张川

重症急性胰腺炎（severe acute pancreatitis，SAP）是临床比较常见的疾病，发病机制复杂。近年来，研究发现NOTCH受体与SAP发病可能存在关联，但缺乏对其影响机制的阐述［1-2］。NOTCH受体包括4种同源分子，分别为NOTCH-1、NOTCH-2、NOTCH-3、NOTCH-4，它可激活邻近细胞膜配体，并对各生物学效应进行介导［3-4］。CSL蛋白作为其配体对多种因子有调控作用，它在线虫、哺乳动物中均有表达，参与了多类细胞分化过程［5］。既往研究中针对SAP与Notch-1信号表达的研究较少，尚未完全明确Notch-1信号对SAP的作用机制。本研究旨在分析Notch-1信号表达与重症急性胰腺炎的关系，便于进一步了解该病的发生、进展机制，为疾病治疗提供依据，现报道如下。

1 资料与方法

1.1 实验对象

选取60只雄性成年SD大鼠进行研究，样本源于中国医学科学院动物研究所。大鼠体重190～225 g，平均（211.53±7.54）g。针对大鼠注射浓度不同的牛磺胆酸钠，建重症、轻型急性胰腺炎大鼠模型各30只，分别作为轻型组、重症组。

1.2 建立模型

主要试剂为牛磺胆酸钠、846合剂、戊巴比妥钠。大鼠分别在建模前6 h、12 h禁水、禁食，注射浓度为1%的戊巴比妥钠行麻醉，切口位置为上腹正中处，将胰胆管显露，针对肝门部位的胰胆管，经血管夹给予夹闭，选取十二指肠壁，经静脉针进行穿刺，达胰胆管后刺入，深度为1 cm。将胆总管末端捏闭，取牛磺胆酸钠（浓度为3%与0.5%）经生理盐水稀释，充分混合后注入，剂量1 mL/kg，速度为0.06 mL/min。完成注射后，观察15～25 min。当胰腺变成暗红色，伴有出血、红肿表现后，提示建模成功［6］。确保成功建模后，将手术工具撤除，并对穿刺口行缝合、关腹，术后常规给予液体复苏。建模成功后，于术后0 h、4 h、6 h、8 h、16 h、24 h、48 h采集胰腺组织样本。在术后0 h、12 h采集股静脉血，经离心机离心10 min，转速为13 000 r/min，分离血清，存放于-70℃冰箱内等待检测。

1.3 Notch-1检测

1.3.1 提取胰腺组织DNA

在提取前，首先经研钵锡纸对胰腺组织进行包裹，在高温（170～180℃）下烘烤，时间为8 h。将β巯基乙醇加入RLT Plus缓冲液，按照说明书将乙醇加入AW1、RPE、AW2缓冲液内，制备成工作液。从低温冰箱内取出样本，并进行消融处理，取15 mg组织，置于研钵内（含液氮），将其磨为细粉，取RLTPlus裂解缓冲液600μL，再次研磨，直到均质化。当研钵复温后，经EP管吸入裂解液，离心8 min（12 000 rpm）。分离上清液，置于收集管（带有AllPrep DNA提取柱）内，离心30 s（12 000 rpm）。选取一个新的收集管置于AllPrep DNA提取柱内，放置在室温下，便于DNA纯化。将标本加入提取柱，封口，离心15 s（12 000 rpm）。取RPE缓冲液500μL加入提取柱，封口，离心15 s（12 000 rpm）。将提取柱膜洗脱，弃滤过液。再取RPE缓冲液500μL加入提取柱，封口，离心2 min（12 000 rpm），将提取柱膜洗脱。选取新的收集管，置于提取柱内，取无RNA酶的水40μL，加入提取柱膜，离心60 s（12 000 rpm），提取RNA。取新收集管置于提取柱内，取EB缓冲液100μL，加入提取柱膜，封口，孵育60 s（室温状态下），离心60 s（12 000 rpm），提取DNA。

1.3.2 反转录

经反转录试剂盒使总mRNA反转录成cDNA，条件如下：42℃15 min，95℃5 min，4℃30 min，存放于-20℃冰箱内。qRT-PCR反应：50℃2min，95℃10min，（95℃15 s，60℃1 min，40个循环）。针对PCR产物给予凝胶电泳，计算Notch-1表达量。

1.3.3 免疫组化检测

取部分大鼠胰腺组织行石蜡切片，经免疫组化法测定Notch-1信号通路蛋白表达量，具体如下：①在恒温箱（60℃）内烘烤50min，常规脱蜡，酒精梯度脱水，经自来水冲洗，置于PBS冲洗液内浸泡2 min；②行抗原修复，待其自然冷却后，置于PBS冲洗液内浸泡2 min；③取3%过氧化氢滴于切片，在室温下反应15 min；④加一抗，设PBS阴性对照，在室温下反应90 min；⑤经PBS冲洗液清洗3次，2次/min；⑥加辣根酶标记羊抗兔IgG多聚体，在室温下反应20 min；⑦DAB显色，行苏木精复染；⑧酒精梯度脱水，树脂封片。选取5～10个高倍视野（×400倍）在光镜下进行观察，分析阳性细胞计数，以出现棕黄色颗粒样染色时，视为阳性。

1.4 观察指标

比较重症、轻型急性胰腺炎大鼠中Notch-1的表达量，观察术后0 h、4 h、6 h、8 h、16 h、24 h、48 h Notch-1表达的变化情况，明确峰值。绘制受试者工作特征曲线（Receiver operating curve，ROC）分析Notch-1 mRNA表达量峰值对SAP的预测价值。在建模成功后采集3 mL股静脉血样，离心15 min（3 000 r/min），分离血清，经全自动生化分析仪（迈瑞BS-490）测定血清白介素-6（interleukin-6，IL-6）、白介素1β（interleukin-1β，IL-1β）水平。经Pearson线性相关分析SAP大鼠Notch-1 mRNA表达量峰值与IL-6、IL-1β的相关性。

1.5 统计学方法

采用SPSS 20.0统计软件处理两组临床资料，计量资料用¯±s表示，采用t检验，重复测量数据采用重复测量方差分析。利用ROC曲线分析Notch-1 mRNA表达量峰值对SAP的预测价值，经Pearson线性相关分析SAP大鼠Notch-1 mRNA峰值与IL-6、IL-1β的相关性。P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 两组术后不同时点的Notch-1 mRNA表达量比较

两组Notch-1 mRNA表达均从术后4 h开始明显增高，其中轻型组峰值出现在术后16 h，重症组出现在术后8 h。重症组术后4 h、6 h、8 h、24 h、48 h的Notch-1 mRNA表达量显著高于轻型组（P＜0.05），见表1。

2.2 Notch-1 mRNA峰值对SAP的预测价值

Notch-1 mRNA峰值预测SAP的曲线下面积为0.674（标准误=0.070，P=0.021，95%CI=0.536～0.812），最佳截断值为1.361，敏感度为72.40%，特异度为67.70%。

2.3 两组血清IL-6、IL-1β比较

重症组血清IL-6、IL-1β高于轻型组，组间比较差异显著（P＜0.05），见表2。

表1 两组术后不同时点的Notch-1 mRNA表达量比较（¯±s）

表1 两组术后不同时点的Notch-1 mRNA表达量比较（¯±s）

注：F时间=26.985，F组间=18.151，F交互=9.895，P均 ＜0.001。与组内0 h比较，*P＜0.05；与组内8 h比较，△P＜0.05；与组内16 h比较，#P＜0.05

0 h 4 h 6 h 8 h 16 h 24 h 48 h轻型组 30 0.12±0.07#0.18±0.04*△#0.20±0.06*△#0.71±0.27*#0.82±0.23*△0.51±0.11*△#0.54±0.15*△#组别 n重症组 30 0.10±0.08#0.72±0.16*△#0.75±0.11*△#1.96±0.23*#0.58±0.10*△0.69±0.14*△#0.65±0.11*△#

图1 Westernblot检测轻型、重型急性胰腺炎的Notch-1蛋白表达量 注：m为轻型，s为重型

图2 高倍镜视野（×400倍）下轻型、重型胰腺炎组织中Notch-1信号通路蛋白表达 图①为轻型，图②为重型，可见Notch-1信号通路蛋白阳性表达集中于PanINs上皮细胞、胰腺炎萎缩腺泡细胞的细胞核内，此外，在部分纤维细胞、间质炎症细胞的细胞核内也有阳性表达

图3 Notch-1 mRNA峰值预测SAP的ROC曲线

表2 两组血清IL-6、IL-1β比较（¯±s，pg/mL）

表2 两组血清IL-6、IL-1β比较（¯±s，pg/mL）

组别 n IL-6 IL-1β 30 86.42±11.13 41.29±6.38重症组 30 119.43±24.76 58.62±7.51 t值轻型组6.660 9.626 P值--0.000 0.000

2.4 SAP大鼠Notch-1 mRNA峰值与IL-6、IL-1β的相关性

Pearson线性相关分析提示Notch-1 mRNA峰值与IL-6、IL-1β呈正相关（r=0.588、0.696，P=0.031、0.023），见图4、图5。

图4 Notch-1 mRNA峰值与IL-6的线性相关图

图5 Notch-1 mRNA峰值与IL-1β的线性相关图

3 讨论

本研究发现重症急性胰腺炎大鼠术后4 h、6 h、8 h、24 h、48 h的Notch-1 mRNA表达量较轻型者显著增高，其中重症组峰值出现于术后8 h，而轻型组出现于术后16 h，提示两组Notch-1峰值出现的时点存在差异。Notch最早在果蝇中被发现，它能利用局部细胞相互影响、相互作用的特点，完成细胞间通讯信号传导，并实现细胞核内转录，对细胞分化、迁移等进行调节［7-9］。研究表明SAP细胞凋亡与Notch-1表达存在关联，对正常胰腺组织而言，凋亡细胞数量非常少，Notch-1表达也较少，而一旦出现急性胰腺炎，则凋亡细胞数量在短时间内急剧上升，Notch-1表达也增高［10-12］。该研究为本研究的开展提供了理论依据，笔者发现在两组Notch-1从发病后4 h内开始明显上升，这意味着细胞凋亡数量也相应增加，且重症患者的Notch-1表达增加更明显，提示其细胞凋亡更严重。重症患者在发病后8 h出现峰值，其表达量之后有所下降，但仍处于较高水平。

尽管以往有研究已经指出Notch-1 mRNA在轻、重型胰腺病变中有差异，但仅为初步研究，并未对其诊断的界值进行观察［13-14］。本次研究笔者通过绘制ROC曲线，证实Notch-1 mRNA峰值对SAP预测有一定价值，为本文的创新，最佳界值为1.361，曲线下面积达到0.674，但更为可靠的界值仍需后期扩大样本量、排除干扰因素（如样本浊度、操作技巧等）（什么干扰因素？）。Notch不仅对多种细胞增殖、凋亡有调节作用，而且能选择细胞死亡方式。研究表明Notch-1上调对并T-细胞凋亡有抑制作用，然而，Notch-1上调却不利于对胰腺癌细胞进行抑制，当Notch-1下调时，才可诱导胰腺癌细胞凋亡［15］。由此可见，Notch-1对细胞调节具有双重作用。本研究结果提示重症组血清IL-6、IL-1β高于轻型组，提示与轻型者相比，重症者的炎症反应更重。IL-1β是反映SAP患者炎症程度的重要指标，它可将级联反应启动，对多种炎症因子分泌有促进作用，从而使炎症反应加重［16-17］。此外，它还能导致微循环损害，引起胰腺坏死、水肿等表现［18-19］。IL-6在内毒素影响下释放量增加，它能调节机体炎症、免疫反应，与SAP病情严重度呈正相关［20-22］。本研究也证实随着胰腺炎患者病情加重，血清IL-6、IL-1β明显增高。

研究表明Notch可调控炎症因子的表达，它在B淋巴细胞、T淋巴细胞中均有调控作用，但关于其与炎症因子的相关性鲜有报道［23-25］。笔者经Pearson线性相关分析发现Notch-1 mRNA峰值与IL-6、IL-1β有相关性，随着Notch-1增高，血清IL-6、IL-1β也增高，存在正相关关系。这表明在急性胰腺炎进展过程中，Notch-1信号通路可能通过调节IL-6、IL-1β水平，加重机体炎症反应，从而使病情进展为SAP。

综上，与轻型急性胰腺炎患者相比，Notch-1在重症患者胰腺组织中的表达量明显增高，它与IL-6、IL-1β呈正相关，对二者有调控作用，临床需引起重视。本研究也有局限性，主要为样本量较少，未来将扩大样本量对此进行分析。