肉毒神经毒素小分子抑制剂的研究进展

田自有，陈赛贞，周金明，梁 斌

（1.浙江省台州市中心医院台州学院附属医院药剂科，浙江台州318000；2.中国医学科学院医药生物技术研究所，北京100050）

肉毒神经毒素（botulinum neurotoxins，BoNT）于1987 年首次被发现，是由一种广泛分布于自然界的革兰阳性厌氧芽孢菌：肉毒梭状芽孢杆菌（肉毒梭菌，Clostridium botulinum）在厌氧环境中分泌得到的，是真空包装食品引起的食物中毒的主要原因之一。迄今共发现7 种结构和功能相关的BoNT，分别被称为血清型A～G（BoNT/A～G）。其中A 型（BoNT/A），B 型（BoNT/B），E 型（BoNT/E）和F 型（BoNT/F）BoNT 可引起人类中毒，BoNT/A最为常见，它是世界上已知的最致命的毒素之一，其对人的LD50约为1 ng·kg-1，被美国疾病控制与预防中心（United States Centers For Disease Control and Prevention，USCDC）列为A 类生物威胁试剂。而BoNT/F 引起的人类中毒非常少见。BoNT/A 和BoNT/B在神经元胞质中活性保持最久（根据使用的剂量和部位，可处于活性状态几周或数月）。目前，BoNT/A（Botox 和Dysport）和BoNT/B（Myobloc）是美国FDA批准的可商业购买的药物，临床上被广泛用于治疗神经类疾病，如帕金森病（Parkinson disease，PD）、尿失禁、痉挛和局部性肌肉张力障碍等［1-2］。BoNT/A和BoNT/B 最常见的用途是在美容上，局部注射BoNT/A 或BoNT/B 是世界上最常用的非手术美容（减少皱纹的产生）手段。然而，大量的临床研究表明，局部注射BoNT 会直接或间接影响到非治疗的部位，严重的会造成肌肉瘫痪。此外，由于BoNT具有对人类的强毒性，制作简单和运输方便等特点，在过去的20多年来它一直都是恐怖组织非常热衷的生化武器之一。目前，临床上对于BoNT 中毒的治疗是基于及时诊断和使用BoNT 类毒素疫苗和抑制性的抗体，然而这些治疗手段仅限于BoNT 进入神经元之前。事实上，当人们发现BoNT中毒时，都已发生明显的临床症状，如局部肌肉麻痹和呼吸困难等症状，BoNT 已进入神经元。目前，对于BoNT 已进入神经元的中毒仍无有效治疗药物。近年来，随着对BoNT 结构和中毒机制的深入研究，激起了人们对BoNT 抑制剂的研究［3-4］。由于小分子抑制剂相对于抗体，肽类化合物而言，具有易得、相对稳定、成本低和易运输到靶点等特点，成为当前生命科学领域研究的热点。本文主要综述近年来BoNT小分子抑制剂的研究进展。

1 Bo NT的结构及其引起中毒的分子机制

对于BoNT 的结构研究已很深入，大量的文献报道了BoNT 相关的晶体结构［5-7］。对BoNT 的基因序列及晶体结构的研究表明，BoNT/A，BoNT/B和BoNT/E 具有结构和功能相似的结构域，但它们结构域的排列是不同的。所有的BoNT分子都是由一根无毒的～150 ku多肽链经蛋白水解作用裂解成一根50 ku 的轻链（light chain，LC）和一根100 ku的重链（heavy chain，HC），两者经二硫键链接，同时由HC 伸出的一根“带”通过非共价键作用环绕LC 形成完整的BoNT 分子（图1）。LC 是BoNT 的有毒的催化结构域（catalytic domain），是锌肽链内切酶，具有高选择性酶切相应的SNARE 蛋白。所有的BoNT LC的结构具有31%～59%氨基酸序列相似性，对各自的底物有着高度的选择性。BoNT/A和BoNT/B 选择性的酶切（25 ku 突触小体相关蛋白，synaptosomal-associated protein of 25 ku，SNAP-25），BoNT/E选择性的酶切小泡相关膜蛋白（vesicleassociated membrane protein，VAMP）。HC 是使BoNT 专一性结合神经细胞的关键因素，它由2 个结构域组成：N-跨膜转运域（trans ocation domain，HCN），其主要功能是将BoNT分子跨膜迁移进入神经元；C端受体结合域（binding domain，HCC），其主要功能是使BoNT分子与细胞表面的受体结合。其中HCC是由2 个亚结构域：N 端（HCCN）和C 端（HCCC）组成。HCCN的氨基酸序列在所有的BoNT分子中具有很高的相似度，其功能主要是促进毒素与神经元蛋白受体的高亲和性结合。HCCC的主要功能是促进与神经元质膜中的低亲和性受体—神经节苷脂的结合。

图1 A型肉毒神经毒素（Bo NT/A）的晶体结构（PDB entry：3BTA）及结构域［2-3］.

在细胞水平上，所有已知的BoNT对靶细胞的作用都是通过4 个步骤实现的：①BoNT 与神经细胞表面的受体或具有内吞作用的间接受体结合；②接着通过受体介导的内吞作用进入神经细胞；③硫-硫（S-S）键断裂，HC 和LC 分离，由内吞小泡酸化在膜上产生一个离子通道，LC由此通道从小泡转运到胞浆；④最后在胞内由具有蛋白酶活性的LC酶切在递质释放过程中起重要作用的SNARE蛋白，从而抑制突触小泡内的神经递质释放，阻断突触传递，导致肌肉麻痹，严重会导致呼吸麻痹而死亡。

2 靶向Bo NT/A 轻链锌活性位点的小分子抑制剂

由于LC是BoNT的有毒活性部位，直接阻断了对肌肉的神经传导，因此在药物化学领域中LC 被认为是一个非常重要的药物靶标蛋白。因此，最常见的BoNT 小分子抑制剂的筛选策略主要是以BoNT LC的活性位点为结合口袋，筛选可与其酶活性中心的Zn2+螯合的小分子化合物。近年来，8-羟基喹啉（quinolinol）类化合物作为靶向BoNT/A LC的活性位点的小分子抑制剂受到了广泛的关注。8-羟基喹啉片段与酶活性中心的Zn2+形成双配位键，而且8-羟基喹啉类化合物与其他金属蛋白酶抑制剂的结构不同，且具有相对分子质量小、易进行结构改造等优点，方便构效关系的深入研究，但到目前为止，仍未得到BoNT/A LC与8-羟基喹啉类化合物复合物的晶体结构。2009 年，Roxas-Duncan等［8］以BoNT/A LC 活性位点为靶点，通过计算机模拟对接对美国国立癌症研究所（National Cancer Institute，NCI）化合物库进行虚拟筛选，结合生物活性测试得到了2个低细胞毒性的8-羟基喹啉类小分子抑制剂1 和2（图2），其IC50分别为1.6 和（1.86±0.25）μmol·L-1，且在Neuro-2a 细胞和体外实验中有效地抑制BoNT/A 对SNAP-25 的阻断作用。化合物1 和化合物2 的衍生物3 被成功分离为一对消旋异构体，并发现（+）-R-3和（-）-S-3（图2）的IC50均约1.5 μmol·L-1。对这对对应异构体的分子模拟研究表明，它们与BoNT/A LC 蛋白的结合模式不同，但具有相同的结合能［9］。Caglicˇ等［10］通过对188个8-羟基喹啉类化合物进行筛选得到了8-羟基喹啉类小分子抑制剂4（图2），其IC50为0.9 μmol·L-1，该分子在细胞水平表现出了良好的抑制活性，且细胞毒性较低，水溶性好。并对其药代动力学进行了研究，发现4 在大鼠和人的肝微粒体中的半衰期分别为20.3 和116.0 min，而在血清中的半衰期分别为98.5和92.2 min。Minnow等［11］通过动态实验证明了8-羟基喹啉类化合物5（MSU58）和6（MSU84）（图2）是BoNT/A LC的竞争性抑制剂，其IC50分别为（3.3±0.3）μmol·L-1和（5.8±2.3）μmol·L-1。同年，Bremer 等［12］报道合成了一系列8-羟基喹啉类化合物并对其构效关系（structure activity relationship，SAR）进行了研究，发现5-磺酰基和2-氨基取代的8-羟基喹啉类化合物7-10（图2）对BoNT/A LC 的Ki＜1 μmol·L-1，其中化合物7 和9 在细胞水平上有效地抑制了BoNT/A LC 对SNAP-25 的切断，有效地缓解了BoNT/A对肌肉的麻痹。

图2 靶向Bo NT/A轻链锌活性位点的8-羟基喹啉类小分子抑制剂［8-12］

异羟肟羧酸类化合物也是研究较多的一类BoNT/A LC 小分子抑制剂。Boldt等［13］通过高通量筛选并对先导化合物进行结构优化得到了2，4-二氯本丙烯酰异羟肟酸11（图3），其IC50值为（0.41±0.03）μmol·L-1，Ki值为（0.3±0.012）μmol·L-1。并得到了第一个BoNT/A LC与小分子复合物的晶体：BoNT/A LC-11复合物，对其晶体结构分析表明，11结合于酶的活性位点，异羟肟酸片段取代了起催化作用的水分子，其羟基氧原子与锌离子结合［14］。基于这些信息，一系列靶向BoNT/A LC活性位点的的异羟肟羧酸类小分子抑制剂被报道。经过进一步的结构优化得到了11 的类似物12 和13（图3），其IC50值分别为（0.69±0.05）μmol·L-1和（0.56±0.15）μmol·L-1［15-16］。Stowe等［17］报道合成了手性化合物R-14（图3），其Ki值为（0.16±0.02）μmol·L-1。通过对BoNT/A LC 与R-14 复合物的晶体结构分析，得出结论：分子手性是得到潜在高活性的BoNT/A LC活性位点抑制剂的关键。此外，将金刚烷片段引入11 中取代其芳香基团，得到了化合物15（图3），其IC50值为（0.46±0.08）μmol·L-1［18］。基于对BoNT/A LC与化合物15复合物的晶体结构分析指导进一步的结构优化，得到了P-氯-苯基取代的化合物16（图3），其IC50值为（0.027±0.004）μmol·L-1，是目前该类化合物中对BoNT/A LC 抑制活性最好的化合物［19］。Thompson 等［20］报道研究了异羟肟羧酸类小分子化合物与BoNT/A LC复合物的晶体结构，其中活性最好的小分子化物17（图3），其IC50值为4.6 μmol·L-1。研究表明，在BoNT/A LC 与小分子化合物形成复合物后，BoNT/A LC的活性位点空腔发生了明显的变化，而且在活性位点空腔口的60/70 回弯处构象变化最大。综上所述，虽异羟肟羧酸类小分子化合物与BoNT/A LC 的复合物的晶体结构已有报道并有效地指导该类小分子化合物的SAR 改造，有些异羟肟羧酸类化合物对BoNT/A LC有较好的抑制活性，然而该类化合物具有高溶剂化特点，使得其口服吸收和透膜性都较差。因此，通过对该类化合物前药的研究或许可找到类药性较好的BoNT/A LC小分子抑制剂。

图3 靶向Bo NT/A轻链锌活性位点的异羟肟羧酸类小分子抑制剂［13-20］.

3 与BoNT/A轻链共价结合的不可逆小分子抑制剂

2010年，Capková等［21］首次报道了与BoNT/A LC共价键结合的不可逆小分子抑制剂18（图4），该化合物是基于异羟肟羧酸类化合物11的结构改造得到的，其对SNAP-25抑制的Kinact/Ki=520 M-1s-1，与基质金属蛋白酶（Matrix metalloprotease，MMP，MMP与BoNT/A LC结构相近）相比，化合物18对BoNT/A LC具有较高的选择性。采用荧光共振能量转移法（fluorescence resonance energy transfer，FRET）对包含70 000个化合物的化合物库进行高通量筛选，得到了通过共价键链的高选择性BoNT/A LC的小分子抑制剂苯并咪唑取代的丙烯腈类化合物19（图4），其对SNAP-25抑制的Kinact/Ki=979 M-1s-1，IC50=7.2 μmol·L-1。对化合物19作进一步的结构改造得到了化合物20（图4），其对抑制SNAP-25 断裂 的Kinact/Ki=326 M-1s-1，IC50=7.2 μmol·L-1。化合物20在鸡神经细胞中有效地抑制了BoNT/A LC对SNAP-25的切割作用［22-23］。

图4 与Bo NT/A轻链共价结合的不可逆小分子抑制剂［21-23］.

4 靶向Bo NT/A 轻链Exosite的小分子非竞争抑制剂

图5 靶向BoNT/A轻链外接位点的小分子抑制剂[25-28].

Breidenbach 等［24］首次报道了在BoNT/A LC活性位点周围还存在另外2个结合口袋α-外接位点和β-外接位点，这一发现提供了抑制BoNT/A LC活性的新靶点。α-外接位点位于BoNT/A LC 活性位点的背面，由4个螺旋组成，是底物特异性的决定性因素；β-外接位点位于BoNT/A LC活性位点附近的动态回弯区，它对于底物的特异性作用不大，但由于它与底物SNAP-25 之间通过3 条反平行的β-折叠相互作用，因此，β-外接位点是决定底物的活性关键因素。Silhár 等［25］通过高通量筛选得到了第一个α-外接位点小分子抑制剂天然产物D-菊苣酸（Dchicoric acid）21（图5），其Ki=0.7 μmol·L-1。同年该小组高通量筛选约翰·霍普金斯临床化合物库（Johns Hopkins Clinical Compound Library，其中包含1500 个已知药物）得到了第一个β-外接位点的小分子抑制剂天然产物洛莫真菌素22（Lomofungin）（图5），其Ki=（6.7±0.7）μmol·L-1。21和22分别与羟肟酸类活性中心抑制剂11 都有协同抑制作用，此外，21，22和113者之间也表现出协同抑制作用［26］。接下来，Bremer等［27］对洛莫真菌素进行结构改造，得到了活性更高的β-外接位点小分子抑制剂CBIP 23（图5），其IC50=2.9 μmol·L-1。Hu等［28］采用副本交换分子动态模拟法（replica-exchange molecular dynamic simulation，REMD simulation）得到了到迄今活性最好的小分子抑制剂24（图5），其Ki=0.09 μmol·L-1，IC50=（0.5±0.2）μmol·L-1。图5靶向BoNT/A LC外接位点的小分子抑制剂［25-28］。

5 Bo NT/A的其他类型的小分子抑制剂

抑制BoNT/A 中毒的另外一种途径就是抑制BoNT/A 进入到神经细胞内。BoNT/A 进入神经细胞主要是通过发动蛋白（dynamin）的内吞途径来实现的。Harper 等［29］报道了发动蛋白抑制剂Dyngo-4a 25（图6）具有抑制BoNT/A 进入到海马神经元，而且在小鼠模型中可延迟BoNT/A中毒。Seki 等［31］基于25中的多酚羟基片段与21结构相似性，通过实验得出25除可抑制BoNT/A进入神经细胞，同时还可靶向α-外接位点和β-外接位点来实现抑制BoNT/A LC 的活性，其IC50=（6.25±1.02）μmol·L-1。尽管细胞水平上的实验（hiPSCa神经元细胞）表明25主要是抑制BoNT/A 进入神经细胞，然而小鼠实验则表明25 对BoNT/A LC 蛋白酶的抑制作用，化合物25 是第一个BoNT/A 的多靶点药物［30］他们通过细胞水平活性筛选，得到了琥珀酰亚胺类BoNT/A 抑制剂26（图6），其EC50=4.9 μmol·L-1。进一步的机制研究表明，化合物26是通过靶向抑制硫氧还蛋白还原酶（thioredoxin reductase，TrxR）的自杀底物抑制机制，从而抑制了BoNT/A 迁移进入细胞。由于所有的BoNT 都要在TrxR 的辅助作用下迁移进入细胞，因此基于化合物26 的作用机制，将会得到对所有BoNT都有抑制作用的小分子抑制剂。

图6 靶向Bo NT/A轻链的其他类型小分子抑制剂［29-31］.

6 靶向Bo NT/B 轻链与Bo NT/E 轻链的小分子抑制剂

相对于BoNT/A，对BoNT/B 与BoNT/E 的小分子抑制剂的研究报道较少。目前仍然无可用于临床治疗的BoNT/B 和BoNT/E 引起中毒的小分子抑制剂。BoNT/B选择性地在Gln76和Phe77之间酶切底物VAMP。Adler 等［32］在缺乏BoNT 的单晶衍射的数据的情况下，于1998年报道了最早的BoNT/B LC小分子抑制剂：27（ICD1578）（图7），其IC50是27.6 μmol·L-1，27 最初设计为MPP 抑制剂。锌离子螯合剂28（BABIM）（图7）对BoNT/B LC 的抑制作用较弱（IC50=5～10 μmol·L-1）。对比BoNT/B LC和28-BoNT/B 的复合物的晶体结构，发现在28-BoNT/B LC 的复合物中，有2 分子的28 与BoNT/B LC 活性中心的锌离子螯合，其中一个28 进入转运结构域和催化域之间的缝隙内，而另一个28位于转运结构域和受体结合域之间。从这些复合物的晶体结构可见，在抑制剂作用下活性位点的微环境发生了变化，起催化作用的锌从活性位点跑到了蛋白的其他位置［33］。

图7 靶向Bo NT/B轻链的小分子抑制剂［32-33］

与其他血清型BoNT相比，BoNT/E中毒速度最快，它专一性地在Arg180 和Ile181 之间切割底物SNAP25。Agarwal等［34］报道了BoNT/E LC活性中心的晶体结构及其与底物类似物抑制剂（SNAP-25的衍生物）RIME 的复合物的晶体结构。该小组使用这些晶体结构，通过基于蛋白质结构的计算机虚拟筛选及HPLC 的测试法于2012 年首次报道了BoNT/E LC 的小分子抑制剂：芴类化合物29〔Ki=1.29 μmol·L-1，IC50=（48.5±6.5）μmol·L-1〕（图8）。根据化合物29 与BoNT/E 的活性中心的分子对接模式可见，与BoNT/E LC-RIME 作用模式类似，苯甲酸中的C=O与Zn螯合并与Tyr350形成氢键［35］。在此基础上以芴为药效团，该小组得到了活性和结构与29相近的化合物30-33（图8）［36］。Zhou等［37］采用相同的策略，基于与肽类抑制剂RIME的‘足迹相似性’（footprint similarity，FPS）筛选，得到了目前为止活性最好的BoNT/E LC 小分子34（图8），其IC50为（14.2±1.7）μmol·L-1，比29 活性强3 倍。根据化合物34 与BoNT/E 的活性中心的分子对接模式可见，与BoNT/E LC-RIME作用模式类似。

7 结语与展望

根据BoNT 对靶细胞的作用的4 个步骤，人们提出了治疗BoNT中毒的不同策略，主要包括以下几种：①抑制BoNT通过内吞作用进入神经元细胞，如发动蛋白抑制剂Dyngo-4a 25［30］；②通过靶向TrxR抑制S-S键的断裂，该策略可得到对所有BoNT都有抑制作用的小分子抑制剂［31］；③靶向BoNT LC 的小分子抑制剂；④多靶点小分子抑制剂［30］。

由于BoNT 通过内吞作用进入神经元细胞，并在TrxR催化作用下的S-S键断裂得到LC和HC的速度很快，限制了该类小分子抑制剂使用的时效性。此外，BoNTLC 进入到胞浆后稳定性好，半衰期长，还可高选择性地酶切SNARE蛋白，从而导致较长时期的BoNT中毒。因此，靶向BoNT LC的小分子抑制剂是治疗BoNT中毒的有效策略。但由于BoNT LC 是锌肽链内切酶，它与底物（SNAP-25 或VAMP）之间的作用模式非常复杂，具有结合位点多（锌活性位点，α-外接位点和β-外接位点等），结合口袋的柔性和空腔大等特点，因此，BoNT 的LC 是一个很难靶向的靶点。目前，BoNT/A LC的小分子抑制剂的研究最多，其次是BoNT/B/E。8-羟基喹啉类和异羟肟羧酸类是目前研究较为深入的BoNT/A LC 的锌活性位点小分子抑制剂，有些已达到nmol级活性。但他们的药动学性质较差，即药物的吸收，分布，代谢，排泄和毒性（absorption，distribution，metabolism，excretion，toxicity，ADMET）。对于以口服或注射方式给药的肉毒神经毒素小分子抑制剂，首先，最重要的是有足够的小分子抑制剂到达并进入到靶向的神经细胞，如对于BoNT/A LC的小分子抑制剂，当其体外的神经细胞抑制活性＞90%时，才会在动物的体内实验中有效地抑制BoNT 中毒。文献报道的很大一部分BoNT LC 的小分子抑制剂的透膜性，类药性较差，不能进入靶向的神经细胞，而对于可进入神经细胞的BoNT LC的小分子抑制剂的体外实验的抑制活性和药物耐受性较差，对其ADMET的研究不足。此外，肉毒神经毒素在血液中是很稳定的，其主要靶向胆碱神经末梢（运动神经元）细胞并迅速进入该细胞而不会在其他细胞或组织内聚集。因此，提高小分子化合物在神经细胞中抑制BoNT/A LC，降低其对其他细胞和组织的毒性以及提高其药动学ADMET性质，是决定这些化合物能否进入临床使用的关键因素。

图8 靶向Bo NT/E轻链的小分子抑制剂［34-37］.

此外，人们又提出了多靶点的策略［30］。如化合物Dyngo-4a 25（图6），靶向BoNT对靶细胞作用的2 个阶段，即抑制了BoNT/A 进入神经细胞，同时还可靶向α-外接位点和β-外接位点来实现抑制BoNT/A LC的活性，并在体内和体外实验上都得到了证实。由于Dyngo-4a 25 的活性较低，不能有效地抑制BoNT 中毒，而且对其ADMET 研究不足。该策略无疑是一种有效抑制BoNT 中毒的有效手段，相信提高该多靶点的小分子抑制剂的活性及其ADMET性质，一定可得到抑制BoNT中毒的有效治疗手段。

BoNT 作为世界上已知的最致命毒素之一，是人类健康和生命的潜在威胁。目前，美国FDA批准的用于BoNT 中毒治疗的主要手段仅适用于BoNT进入神经细胞前的抗体治疗法，或对于有潜在BoNT 中毒风险的人群使用疫苗。然而对于BoNT已进入神经细胞的患者仍然无临床可用的解毒手段。近年来，随着对BoNT 相关晶体结构的解析和对其作用机制的深入研究，以及高通量筛选的测试手段的发展，加速了BoNT 抑制剂的研究。迄今虽仍然无可进入临床实验的BoNT 小分子抑制剂，但有些化合物已具有较好的细胞水平上的和一定的动物水平上的抑制活性。相信在不久的将来，BoNT小分子抑制剂的研发将会取得突破性的进展。