天然彩棉纤维色素形成分子机制研究进展

任慧敏，汤寿伍，宋武，柯丽萍，孙玉强，刘海峰*

（1.中国彩棉（集团）股份有限公司，新疆乌鲁木齐830001；2.浙江理工大学生命科学与医药学院，浙江杭州310018）

天然彩棉是纤维含有天然色素类物质的特殊类型棉花，它无需化学印染，具有绿色环保的特点，故又称为“生态棉”。天然彩色棉纤维具有透气性好，抗静电，吸汗性强等优点。目前，依据对棉纤维色泽的划分世界上公认的天然彩色棉花仅有棕色和绿色两种[1]。根据棉纤维颜色深浅，棕色棉又可分为淡棕色、黄棕色、棕色、灰棕色、深棕色；绿色棉分为绿色短绒、白色纤维和绿色纤维、绿色短绒两种。

1 天然彩色棉纤维的发育及色素沉积

通过对白色棉纤维发育的研究，发现棉纤维是由胚珠外层珠被上单个表皮细胞分化发育而成，其发育的整个过程可分为四个阶段：即纤维发育起始期、伸长期（初生壁增厚期）、次生壁加厚期和脱水成熟期[2-3]，这四个时期是连续、重叠的发育过程，一般经历45～60 d。彩色棉纤维的发育同样经历这4个时期，但在彩色棉纤维发育过程中还伴随色素物质的合成与沉积，从而使棉纤维呈现出天然色彩[4]。已有研究证明色素的形成与纤维长短、纤维素含量以及纤维品质都具有一定的相关性[5-6]。

有研究者利用黑袋子对开花至吐絮时期的彩棉进行套袋实验，证实天然彩色棉纤维色素的形成并非是因为纤维吸收了光线中的某些成分，而是由于色素合成相关基因在纤维细胞中特异表达所导致。通过电子显微镜对比观察发现天然彩棉纤维色素的形成起始于初生壁伸长期之后，与次生壁加厚同时进行[7]。王学德等分别提取棕色棉和绿色棉纤维的色素，并根据提取液的吸光值估计色素含量，认为在开花后15 d左右，棕色棉和绿色棉中的色素已形成和沉积，并在开花后20 d色素含量达到最高峰，随后纤维的颜色逐渐加深[4]。另有研究结果证明棕色棉和绿色棉纤维色素沉积的部位是存在明显区别的，棕色棉主要沉积在中腔内，而绿色棉在中腔及纤维的次生壁内层也有大量色素沉积[5,7-8]。

2 天然彩色棉纤维色素成分研究

为了进一步研究彩色棉纤维色素形成的分子机制，国内外学者首先对天然彩色棉纤维的色素成分进行分析，但是由于色素提取、分离和纯化的方法不同造成即使同一种彩色棉纤维色素所获得的组成成分也有所不同。

根据已有研究报道棕色棉纤维色素成分主要有以下几种可能：（1）儿茶素：Ryser等认为棕色棉短绒呈现的棕色是由于单宁的前体儿茶素及单宁的衍生物导致的，同时推测棕色纤维的颜色可能与位于液泡里的由儿茶素衍化的单宁有关[8-9]。（2）黄酮类化合物：研究者利用紫外吸收光谱分析成熟棕色棉纤维的色素提取物，认为棕色棉纤维色素可能是黄酮类化合物[10]。Hua等通过比较白色棉和彩色棉纤维色素合成和沉积的特点，认为黄酮类化合物可能是天然彩色棉纤维色素的主要物质[11-12]。Feng等通过HPLC分析发现柚皮素、槲皮素、山奈酚和杨梅素在棕色棉纤维中的含量显著高于其在白色棉纤维中的含量，而这四种物质均属于黄酮类化合物，表明棕色棉纤维色素成分极有可能是黄酮类化合物或其衍生物[13]。（3）醌类化合物：有研究者利用“碱溶酸沉”原理结合乙酸乙酯萃取法纯化获得棕色棉纤维色素，进一步通过化学性质的比较鉴定认为棕色棉纤维色素可能是由单宁氧化形成的醌类化合物[14-16]。（4）原花青素（缩合单宁）：还有部分研究者通过类黄酮结构基因表达分析和DMACA染色实验表明类黄酮结构基因和原花青素参与了棕色棉纤维色素的形成[17-18]。随后，有研究团队比较棕色棉纤维和其近等白色棉纤维的蛋白组学分析发现原花青素是棕色棉纤维色素物质的主要成分[19-20]。进一步对提取、分离的棕色棉纤维色素物质利用NMR和MALDI-TOF MS进行分析鉴定，证实构成棕色棉纤维色素物质原花青素的主要结构单元是表倍儿茶素，同时有少量的表儿茶素结构单元[16]。采用香草醛法测定发现棕色棉纤维和种皮中缩合单宁的平均含量均高于其在白色棉纤维中的含量，而且棕色棉纤维中色素含量越高，棉纤维或种皮中缩合单宁的含量就越高，认为棕色棉纤维色素的合成前体是无色的缩合单宁[15,21-22]。近期有研究证实原花青素含量与纤维色泽有一定关联[13,16,19]。

绿色棉纤维色素成分的研究相对于棕色棉纤维来说有些少，已有研究表明绿色棉纤维与棕色棉纤维色素的成分是不同的。最早研究结果认为绿色棉纤维色素中含有有机酸，甾醇、香豆素和黄酮类物质[8-9,23]。随后，有研究者通过脂溶性溶剂对绿色棉纤维色素进行提取，发现提取物中存在苯乙烯酸及其衍生物，并通过相应抑制剂的使用，认为苯乙烯酸及其衍生物是绿色棉纤维产生颜色的重要因素[24-25]。赵向前等发现绿色棉纤维色素除了包含有黄酮类化合物之外，还含有类似芦丁的黄酮醇化合物[10,26]。张小均等研究发现绿色棉纤维色素主要是脂溶性物质，而棕色棉纤维主要是水溶性物质[27]。近期有研究者从绿色棉纤维中分离出三种化合物，分别是22-O-咖啡酰基-22-羟基二十二酸单甘油酯、22-O-咖啡酰基-22-羟基二十二酸和二十七酸单甘油酯[28]。

综上，虽然天然彩色棉纤维色素的具体组分还未明确，但已有研究证实天然彩棉纤维色素成分与植物类黄酮生物合成途径密切相关，而且近期研究报导再次证明类黄酮生物合成途径调控棕色棉和绿色棉色素沉积过程[29]。

3 植物类黄酮生物合成途径

类黄酮化合物是广泛存在于自然界的一大类次生代谢产物，数量之多被列为酚类化合物之首，多数具有颜色，是植物色素的主要成分。类黄酮化合物颜色一般在浅黄至蓝色之间变动，其颜色的显示与细胞质中的辅助色素、金属离子和pH值都有很大关系[30]。目前，研究者已经从不同植物中鉴定出超过5000个自然黄酮类化合物。根据其化学结构进行分类，通常分为以下亚组（表 1）：

表1 黄酮类化合物分类Table 1 The classification of flavonoids

植物类黄酮合成途径是研究最为深入的次生代谢途径之一，花色素苷的生物合成则是该途径中研究比较清楚的代谢途径[31]。植物类黄酮生物合成途径起始于苯丙氨酸，经苯丙氨酸解氨酶（PAL）催化形成肉桂酸，肉桂酸在肉桂酸羟化酶（C4H）的催化作用下形成香豆酸，经4-香豆酸辅酶A连接酶（4CL）催化形成香豆酰辅酶A，随后在查尔酮合成酶（CHS）的催化作用下，香豆酰辅酶A与丙二酰辅酶A反应生成查尔酮，查尔酮（黄色）在查尔酮异构酶（CHI）催化下生成黄烷酮。黄烷酮羟化酶（F3H）催化黄烷酮生成二氢黄酮醇。此后，以二氢黄酮醇为底物存在三条不同的代谢途径，分别是①二氢黄酮醇在类黄酮3'，5'-羟化酶（F3'5'H）的催化作用下形成二氢杨梅黄酮，进而在二氢黄酮醇（DFR）的作用下生成无色翠雀素；②二氢黄酮醇在类黄酮3'-羟化酶（F3'H）的作用下形成二氢槲皮素，同样在二氢黄酮醇（DFR）的作用下生成无色矢车菊色素；③二氢黄酮醇直接在二氢黄酮醇（DFR）的催化作用下生成无色天竺葵色素。三种无色花青素进一步在花青素合成酶（ANS）的催化作用下形成相应的有色但不稳定的花青素，随后，由类黄酮3-糖基转移酶（3GT）将不稳定花青素转化为相应的稳定花青素苷，分别是翠雀素-3-葡萄糖苷、天竺葵素-3-葡萄糖苷（砖红色）和矢车菊色素-3-葡萄糖苷。其中，翠雀素-3-葡萄糖苷和矢车菊色素-3-葡萄糖苷均可以在转甲基酶的催化作用下最终分别形成蓝紫色的锦葵色素（飞燕草色素）和紫红色的芍药花色素（矢车菊色素）。此外，无色花色素和不稳定的花青素还可以分别在无色素还原酶（LAR）和花青素还原酶（ANR）的作用下分别还原为儿茶素和表儿茶素，它们进一步反应生成原花青素并最终氧化成缩合单宁[32-33]。

4 天然彩色棉纤维色素相关结构基因的研究

根据已有研究将类黄酮代谢途径中调控花青素生物合成的基因分为两类：一类是结构基因，即编码类黄酮代谢途径中直接参与花青素苷形成的酶的基因；另一类是调节基因，控制结构基因的表达，从而调节花青素累积的时空模式，如编码MYB，WD40，bHLH等转录因子的基因。

编码类黄酮代谢途径相关酶的结构基因目前在天然彩色棉纤维中几乎都已被克隆鉴定。已有研究者通过同源序列比对等方法从棕色棉纤维中克隆获得类黄酮合成途径中的5个关键基因 ， 包 括GhDFR，GhCHI，GhF3H，GhANS和GhANR[17]。李艳军等筛选获得多个在彩棉中优先表达的cDNA片段，其中包含一个新基因即在类黄酮物质生物合成过程中发挥重要功能的酶基因4-香豆酸-CoA（4CL）[34]。随后，类黄酮合成途径中其余关键结构基因Gh3GT，GhC4H，GhCHS，GhF3'H，GhF3'5'H在棕色棉中也被成功克隆，其中GhC4H，GhF3'H和GhF3'5'H都属于细胞色素P450家族[13,35]。

类黄酮生物合成途径在高等植物中具有很好的保守性。依据植物类黄酮生物合成途径，将已经在棉花中报道的与纤维色素合成相关的结构基因进行相应介绍。

4-香豆酸辅酶A连接酶（4CL）是类黄酮合成途径中的关键酶。在陆地棉中共发现4个编码4CL的基因，命名为Gh4CL1-Gh4CL4。在这四个基因中只有Gh4CL2在绿色棉纤维中的表达量显著高于其在白色棉纤维中的表达，酶动力学分析显示Gh4CL2对底物咖啡酸酯和阿魏酸盐都有很强的活性，而已有研究证实咖啡酸酯可能是绿色棉纤维色素的主要成分，说明Gh4CL2和绿色棉纤维色素生物合成具有一定的相关性[28]。

经查尔酮合成酶（CHS）催化形成的查尔酮为其它类黄酮物质的合成提供了基本碳骨架，因此CHS被认为是类黄酮生物合成过程中第一个关键限速酶,是花色素体内合成途径的调节点。GhCHS1在棕色棉纤维中的表达量显著高于其在近等基因系白色棉中的表达，但是该基因在绿色棉纤维中几乎检测不到，推测该基因可能在棕色棉纤维色素形成中发挥重要作用[36]。梁明炜等发现GhCHS在胚珠和纤维中广泛表达，但在花瓣中几乎没有表达，说明棉花纤维发育及其色素形成过程与花色素体内合成途径密切相关[37]。

查尔酮异构酶CHI是类黄酮生物合成途径中提高黄酮醇含量的关键酶，编码该酶的基因首次从法国豌豆中分离出来。利用RNAi技术将烟草内源CHI基因的表达量降低，发现烟草花瓣和花粉的颜色都变浅，黄酮含量也发生了相应的变化，说明CHI在植物花色调控等方面发挥重要作用[38]。最新研究发现在棕色棉（ZONG1282）中利用农杆菌介导的RNAi干涉GhCHI的表达，其转基因后代纤维色泽除了棕色之外，还出现新的颜色：一种接近于白色，另一种是深绿色。这有力证明GhCHI在纤维色泽形成过程中发挥重要作用[29]。

研究发现在矮牵牛和金鱼草中将编码黄烷酮-3-羟化酶（F3H）的基因突变，会使花色素合成通路受阻，导致产生白色的矮牵牛和金鱼草[39-40]。Tan等人通过杂交将GhF3H基因RNAi片段导入棕色棉（T586）背景中,发现含有GhF3H-RNAi片段的棕色棉植株其花瓣颜色变浅，纤维颜色变深，与预期相反，由此推测可能F3H上游类黄酮物质也是产生棕色棉纤维的因素之一[41]。

黄烷酮 3'，5'-羟化酶（F3'5'H）属于细胞色素P450酶家族中CYP75家族，是产生蓝色的飞燕草色素的一个关键酶。引入外源F3'5'H基因来改变植物花色在多种植物中已获得成功[42]。 已有研究发现，GhF3'5'H主要在纤维发育早期高表达，其在棕色棉纤维和绿色棉纤维中的转录表达水平明显高于其在白色棉纤维中的表达，推测其可能参与彩色棉纤维色素前体物质的合成[43]。

二氢黄酮醇还原酶（DFR）是位于花青素和原花青素合成途径后期的一个关键酶。利用VIGS技术将GhDFR1基因沉默发现显著降低了花青素和原花青素的积累量，而且相对于对照植株，在GhDFR1基因沉默的棉纤维中两种缩合单宁单体（表儿茶素和表没食子儿茶素）的含量严重减少，但同时却检测到儿茶素和没食子儿茶素。进一步将GhDFR1转入拟南芥tt3突变体发现转基因阳性植株种皮能够积累缩合单宁，综合以上结果证明GhDFR1在棉花花青素和原花青素的合成过程中发挥重要功能[44]。

花色素还原酶（ANR）能够将植物中的花色素转化为相应的表儿茶素类物质，这类物质既是原花青素合成的构成单位，也是原花青素聚合的起始单位。研究发现利用病毒介导的基因沉默技术将GhANR1的表达量降低导致在棉花叶片和茎中积累大量的花青素，而原花青素含量明显减少，说明ANR在原花青素生物合成过程中发挥一定功能[45]。

除以上研究，该途径中编码其它酶的基因，包括PAL，C4H，CHI，LAR，ANS，3GT在棕色纤维中表达量显著高于其在白色棉纤维中的表达[16,18,20]。综合现有天然彩棉中对类黄酮生物合成途径结构基因的研究发现，结构基因转录水平的表达变化与天然彩色棉纤维色素的含量具有相关性，从而影响棉纤维色泽的呈现。

5 天然彩棉中类黄酮代谢途径结构基因的转录调控研究

类黄酮合成途径中的结构基因大多通过协同作用发挥功能，而这些结构基因的协同表达可能受一些调节基因的调控，不同调节基因之间通过相互协调决定结构基因的时空表达模式，从而调控植物色泽。目前发现的调节基因主要是编码转录因子家族的基因，已发现的转录因子包括R2R3-type MYB,WD40,bHLH,WRKY,Zinc finger和 MADS box，其中以 MYB-bHLH-WD40三联体（MBW）调控类黄酮合成途径的研究相对深入。已有报导发现在模式植物拟南芥中多个MBW复合体参与类黄酮结构基因的表达调控，如AtDFR，AtANS，AtANR等[46-49]。

MYB转录因子在植物次生代谢、信号传导、生长发育及植物抗逆等过程中发挥着重要的调控作用，其中R2R3-MYBs转录因子在次生代谢途径中对类黄酮生物合成所需酶类发挥正调控或负调控作用。近年有文献报道编码转录因子GhTT2_A07的基因在棕色棉纤维发育过程中其转录水平表达明显上调，与PA积累和色素形成具有很大相关性[50]。研究者从陆地棉中分离获得TT2-型的MYB转录因子GhMYB36和Gh-MYB10，发现GhMYB36和GhMYB10作为MBW复合体的组成部分能够激活棉花中LAR和ANR的启动子，同时GhMYB36和GhMYB10都能够互补拟南芥tt2突变体的功能，说明Gh-MYB36和GhMYB10在原花青素合成途径中发挥重要功能[51]。最新研究发现棕色棉中与TT2同源的GhTT2-3A激活GhbHLH130D，并与GhTT2-3A协同作用促进下游PA结构基因的表达从而调控PA的生物合成和积累，导致棕色棉纤维色泽改变[52]。MYB转录因子除了以MBW三联体发挥功能外，部分MYB转录因子可以单独调控类黄酮生物合成，如拟南芥MYB12可以单独激活类黄酮生物合成过程中CHS/CHI/F3H/FLS1四个结构基因的转录，使其协同表达[53]。此外，将拟南芥MYB转录因子PAP1进行异位表达导致植物多数器官呈现深紫色[54]。这些都为彩棉纤维色泽改良提供了新的研究方向和参考依据。

在植物中，bHLH类转录因子在花器官发育、光形态建成、表皮细胞分化和类黄酮生物合成途径等过程中都发挥功能。在类黄酮生物合成途径中bHLH通常与MYB转录因子共同作用才能发挥其功能[55]。玉米中的R基因和B基因是植物中分离得到的第一个编码参与类黄酮途径的bHLH转录因子[56]。bHLH类转录因子可以调节类黄酮生物合成途径的一条或多条分支，如玉米中ZmR参与花青素合成途径[56]，在拟南芥中TT8能调控花青素和原花青素两条途径[55]。目前，通过同源进化分析已经在不同棉花品种中鉴定发现多个属于bHLH类转录因子家族的基因，但这些基因是否在类黄酮生物合成途径中发挥调控功能还有待进一步详细研究[57]。

WD40（WDR）蛋白是细胞分化、信号转导和囊泡形成以及转运过程中的关键调节因子，该蛋白可以通过调节类黄酮途径控制植物的其它生理发育过程[58]。在 MYB-bHLH-WD40三联体（MBW）中，WD40和MYB以及bHLH成员不一样，它不具有酶活性，无法直接识别靶基因的启动子序列，而主要是通过增强三联复合体的激活作用来发挥其功能[59]。植物中最早报道参与花青素合成过程的WD40转录因子是矮牵牛中的AN11[60]，而拟南芥TTG1是最先发现的以MBW复合体形式参与调控作用的WD40蛋白[61]。在棉花中分离鉴定获得与拟南芥TTG1同源的GhTTG1和GhTTG3，利用紫罗兰ttg1突变体对GhTTG1和GhTTG3的生理功能进行分析发现，表达GhTTG1和GhTTG3的花瓣由纯白色变为带紫色斑点的花瓣，说明GhTTG1和GhTTG3在花青素调控的色素形成过程中发挥重要功能[62]。

转录因子是非常庞大的基因家族，具有很强的调控功能。单个或多个转录因子能够协调控制结构基因的时空表达，从而影响植物色素的累积。但目前这部分的研究极为有限，结合其它植物中转录因子的研究方法及功能报道，通过同源进化比对，在彩棉中挖掘具有类似功能的候选调节因子，检测其对彩色棉纤维中高表达的结构基因的调控作用，以期获得能够改变纤维色泽的转录调控候选因子。

6 展望

天然彩色棉是无污染的绿色生态棉，它符合人们追求绿色环保的要求，但由于其色泽较为单一，因此，深入研究彩色棉纤维色素形成过程及其分子机制是研究者一直关注的热点，同时也是进行彩棉育种和改良的关键。花青素和原花青素合成途径是植物中有关色素合成研究较为清楚的次生代谢途径。综合现有研究报导发现彩色棉纤维色素的形成与该次生代谢途径具有很大相关性，但已有研究多数集中在结构基因转录水平的表达变化，而对于基因本身功能的研究还相对较少，尤其是对于转录调节因子的研究。基于转录因子的高度保守性，可以借鉴其他植物中已有研究结果，对结构基因和转录调控因子进行深入的功能研究。同时可以通过蛋白组学、代谢组学等方法辅助分析获得可能的候选基因，这些都将为彩棉育种提供理论依据；而且可以高效结合基因工程技术在彩棉中进行改良，为彩棉育种开辟新的路径。