中青一号颗粒的提取工艺研究

张新刚，吴晶，贾忠，梁剑平

(1.甘肃德申科技发展有限公司，甘肃 兰州 730000；2.兰州市中医医院，甘肃 兰州 730050 3.兰州市第二人民医院，甘肃 兰州 730046；4.中国科学院近代物理研究所，甘肃 兰州 730000)

菘蓝(IsatisindigoticaFort.)系十字花科两年生草本植物，其根、叶分别为传统中药材板蓝根和大青叶。中青一号系菘蓝新品种，2016年1月通过甘肃省农作物品种审定委员会认定，取得甘肃省农作物品种认定登记证书(甘认药2016007)，并在兰州、天水等地试种[1-2]。前期研究显示中青一号干燥根中(R，S)-告依春含量约为《中国药典》中板蓝根规定含量的20倍以上，且远高于其他市售板蓝根药材。故本研究以中青一号干燥根为原料代替板蓝根，参照临床验方佐以蒲公英、紫菀、地丁等，开发成用于治疗病毒性感冒的中药制剂。采用正交设计，通过测定中青一号中有效成分(R，S)-告依春含量，建立并优化中青一号颗粒(暂定名)提取工艺， 为中青一号的深加工和推广应用奠定基础。

1 仪器与试药

1.1 仪器

电子天平(FA2004B，北京赛多利斯仪器公司)；超声仪(型号：KH-500DE，昆山禾创超声仪器有限公司)；HH-S4 型电热恒温水浴锅(北京科伟永兴仪器有限司)；Waters 2695高效液相色谱仪(美国Waters公司)，Waters 2998光电二极管阵列检测器(美国Waters公司)。

1.2 药材和试剂

中青一号干燥根(来源于兰州榆中县种植基地，批号161002);蒲公英(购自甘肃国草药业有限公司，批号17101109)、紫菀、地丁等药材(购自河北祁新中药颗粒饮片，批号分别为20171201,20171001);(R，S)-告依春对照品(批号：111753-201706，购自中国食品药品鉴定研究院)；板蓝根对照药材(中国食品药品检定研究院，批号：121177-201608)，精氨酸对照品(中国食品药品检定研究院，批号：140685-201707)；硅胶G薄层板(青岛海洋化工有限公司，批号：20171106)；茚三酮、乙醇、正丁醇和冰醋酸为分析纯；乙腈，甲醇均为色谱纯。

2 处方与制备工艺的设计优化

2.1 (R，S)-告依春含量测定

2.1.1 色谱条件

十八烷基键合硅胶为填充剂；色谱柱：Waters XSELECT SSH-C18(4.6 mm×150 mm，5.0 μm)；流速：1.0 mL·min-1；检测波长：245 nm；柱温：27℃；进样量：10 μL；流动相：乙腈-水(15∶85)[3]。

2.1.2 溶液的制备

(1)对照品溶液的制备：取(R，S)-告依春对照品适量，精密称定，加甲醇制成每1 mL含10 μg的溶液，即得。

(2)供试品溶液的制备：取装量差异项下的中青一号颗粒提取物适量，研细，精密称定2.0 g，置100 mL的容量瓶中，加水50 mL，称定重量，超声提取60 min，放冷，用水补足减失的重量，滤过，取续滤液，即得。

2.1.3 测定结果

按照上述色谱条件对对照品溶液和供试品溶液进行分析，结果显示，供试品液和对照品色谱在相对应保留时间位置处均出现色谱峰，方中其他成分对(R，S)-告依春的含量测定无干扰。

2.1.4 线性关系的考察

取(R，S)-告依春对照品适量，精密称定，加甲醇制成每1 mL含1.16 mg的溶液，摇匀作为储备液。精密吸取上述储备溶液0.05、0.1、 0.2、0.4、0.6、1.0、1.2、1.4、1.5 mL至10 mL容量瓶中，用甲醇稀释至刻度，微孔滤膜滤过，取续滤液，分别进样10 μL，测定峰面积，以对照品峰面积为纵坐标(Y)，浓度为横坐标(X)进行线性回归，得回归方程y=8E+06x-36 213(r=0.999 6)，线性范围为0.058～1.740 μg。

2.2 药材吸水率测定试验

按处方比例称取中青一号干燥根(切小段)、蒲公英、紫菀、地丁等，共计100 g，测定吸水率。加水5倍量浸泡，以30 min为间隔观察一次药材浸透情况，记录剩余水量(mL)，直至药材浸透至心(判定标准：容器液面不再下降为止)，试验结果见表1。

表1 全处方药材吸水率考察结果表

试验结果表明，全处方吸水率为125%。本试验将加水量初定最低为药材重量5倍，可将药材完全浸透。

2.3 提取工艺单因素考察

2.3.1 浸泡时间的考察

按2.2方法称取药材，浸泡时间分别为30、60、90、120、150 min，固定加水量20倍，提取1次，提取时间2 h，测出膏率和(R，S)-告依春含量。结果显示，出膏率和(R，S)-告依春含量随浸泡时间相互差别不大，结合实际生产定为30 min。

2.3.2 提取时间的考察

按2.2方法称取药材，提取时间分别为30、60、90、120、150、180 min，固定浸泡时间1 h，加水量20倍，提取/次，测出膏率和(R，S)-告依春含量。结果显示，随提取时间增加，出膏率和(R，S)-告依春含量先增加后趋于稳定。综合实际生产，确定提取时间为120 min、150 min、180 min。试验结果如表2。

表2 加水量单因素考察结果表

2.3.3 提取溶剂用量的考察

按2.2方法称取药材，提取加水量分别为10、14、18、22、26、30倍，固定浸泡时间1 h，提取1次，提取时间2 h，测出膏率和(R，S)-告依春含量。结果显示，随提取加水量增加出膏率逐渐增加而(R，S)-告依春含量先增加后稳定。综合以上，提取加水量定为18、22、26倍。 试验结果如表3。

表3 加水量单因素考察结果表

2.3.4 提取次数的考察

按2.2方法称取药材，提取次数为1、2、3、4、5次，固定浸泡时间1 h，加水量20倍，提取时间2 h，测出膏率和(R，S)-告依春含量。结果显示，随提取次数的增加出膏率逐渐增加而(R，S)-告依春含量先增加后降低。综合实际生产，提取次数定为1、2、3次。试验结果如下表4。

表4 提取次数单因素考察结果表

2.4 正交试验优选水提工艺

2.4.1 全处方正交试验设计

选取提取加水量、提取时间、提取次数为考察因素，以(R，S)-告依春为指标设立L9(34)正交试验设计表(见表5)，确立中青一号颗粒的水提工艺，试验结果见表6、表7。

表5 因素水平表

表6 L9(34)正交试验设计及结果

表7 方差分析结果

注：P<0.05为差异显著；P<0.01为差异极显著

由表6直观分析，(R，S)-告依春含量的极差数据RA>RB>RD>RC，各因素作用主次为A>B >D。综合表7方差分析结果可看出，因素A、B的P<0.01，对(R，S)-告依春含量的影响有统计学意义；而因素D的P>0.05，即提取次数对(R，S)-告依春含量影响无统计学意义。由此为了缩短生产周期，降低生产成本，最佳提取条件为A2B1D2，即以12、10倍水提取2次，每次提取时间为60 min。

2.4.2 提取工艺验证试验

为保证该提取工艺的稳定性和中试生产的可操作，我们对正交试验所得提取条件进行了3批次验证实验，以出膏率和(R,S)-告依春含量作为评价指标，验证结果如表8。

表8 验证结果表

取3批中青一号颗粒粉末0.75 g，加稀乙醇20 mL，超声处理20 min，滤过，滤液蒸干，残渣加稀乙醇1 mL使溶解，作为供试品溶液。另取板蓝根对照药材0.25 g，同法制成对照药材溶液。再取精氨酸对照品，加稀乙醇制成每1 mL含0.5 mg的溶液，作为对照品溶液。参照薄层色谱法(中国药典2015年版四部通则0502)[4]试验，吸取上述三种溶液各2 μL，分别点于同一硅胶G薄层板上，以正丁醇-冰醋酸-水(20∶5∶5)为展开剂，展开，取出，热风吹干，喷以茚三酮试液，在105℃加热至斑点显色清晰。供试品色谱中，在与对照药材和对照品色谱相应的位置上显相同颜色的斑点见图1。

注:1.中青一号颗粒供试品(批号：20170322);2.中青一号颗粒供试品(批号：20170418);3.中青一号颗粒供试品(批号：20170516);4.板蓝根对照药材;5.精氨酸对照品图1 中青一号颗粒薄层色谱图

表8结果显示，三批产品的出膏率和(R，S)-告依春含量相当。通过薄层色谱法(见图1)对颗粒中的中青一号药材进行鉴定，显色斑点与板蓝根对照药材相一致。

3 讨论

中青一号已在兰州、天水等地试种，其亩产量超过当地板蓝根品种20%以上，经测定靛玉红含量可提高1倍以上[5]。该品种有耐旱、耐寒的特性，因此是适合黄土高原半干旱、半湿润地区推广的旱作栽培品种。中青一号颗粒由中青一号干燥根代替板蓝根，与蒲公英、紫菀、地丁共同成方，经提取、干燥、制软材，最终制粒而来。其功效主要为清热解毒、凉血利咽、消肿，用于由肺胃热盛所引起的咽喉肿痛、嗓部痰多腮部肿胀。因组方中蒲公英、紫菀、地丁用量较少，主要以中青一号干燥根即板蓝根的有效成分作为提取工艺的评价指标。板蓝根含有多种活性成分，包括靛蓝、靛玉红、(R，S)-告依春等[6]。其中(R，S)-告依春的抗病毒作用报道最多，被认为与板蓝根的清热解毒作用直接相关[7-8]。此外，上述物质水溶性较好，而本研究主要采取水提工艺，因此最终选择其作为优化提取工艺的评价指标。

本研究以中青一号颗粒的制剂工艺为研究对象，运用单因素和正交试验设计方法，对处方中的中青一号水提工艺进行了工艺优选。单因素试验显示：相较于浸泡时间，延长提取时间可以有效提高(R，S)-告依春的溶出。这是由于告依春有较好的水溶性，当外部浓度较低时，浓度差和渗透压差可以促进(R，S)-告依春自药材(即高浓度部位)向外溶出，当药材内外浓度达到平衡时则告依春再不溶出。其后在考察提取溶剂用量和提取次数时，也验证了这一点。随着提取溶剂量即加水量的增加，出膏率逐渐增加。而(R，S)-告依春含量之所以会出现先增加后稳定的情况是由于药材内、外浓度达到稳态。增加提取次数可增加出膏率，但由于没有新鲜的提取溶剂补充，(R，S)-告依春缺少溶出动力，外部溶剂中的含量不会再增加，反而出现减少。综合单因素试验，我们在正交试验中将溶剂量、提取时间和提取次数作为主要影响因素，结果显示溶剂量和提取时间对(R，S)-告依春的溶出具有显著的影响，而提取次数的影响程度较小。结合实际放大生产经验和成本控制，最终确定最佳提取条件为以12、10倍水提取2次，每次提取时间为60 min。在之后的3批放大试验中，我们看到以上述工艺条件提取的中青一号颗粒，每批的出膏率和(R，S)-告依春含量变化不大，提示优化的提取工艺适用于放大生产过程。同时，薄层色谱法也显示该颗粒中的中青一号药材的斑点与板蓝根对照药材相一致，这为中青一号的开发、推广提供了依据。