商陆均一多糖对小鼠脾细胞增殖及细胞因子分泌的影响

李晓亮，魏娜，王鹏程，匡海学，王秋红

(1.海南医学院，海南 海口 571199；2.黑龙江中医药大学，黑龙江 哈尔滨 150040；3.广东药科大学，广东 广州 510006)

商陆radix phytolaccae又名夜呼(《本经》)、野萝卜、为商陆科植物商陆phytolaccaacinosaroxb.或垂序商陆PhylolaccaamericanaL.的根，多生于树林下、林缘、路旁、山沟等湿润地方，我国大部分地区都有分布[1]。作为传统中药，商陆具有逐水消肿、通利二便、解毒散结的功效；主治水肿胀满、二便不通，外治痈肿疮毒等[2]。商陆中含有多种化学成分，主要为三萜皂苷类、多糖类、酚酸类、甾醇类、黄酮类、鞣质类、挥发油类以及脂溶性成分等[3]。现代药理学研究发现商陆中所含多糖是其增强免疫、抗肿瘤和保护造血功能的活性成分。课题组前期对商陆多糖进行了深入的研究，将商陆总多糖分离纯化得到7种商陆均一多糖[4]。本文通过观察商陆均一多糖对ConA诱导的T淋巴细胞和LPS诱导的B淋巴细胞增殖的影响，为阐明商陆多糖的免疫作用机制提供参考。

1 材料与试剂

1.1 实验药物

商陆总多糖以及7种商陆均一多糖PAP-1、PAP-2、PAP-3、PAP-4、PAP-5、PAP-6和PAP-7均由黑龙江中医药大学北药基础与应用研究教育部重点实验室提供。

1.2 实验动物

清洁级昆明小鼠，雄性，体质量(20±2)g，由黑龙江中医药大学药物安全评价中心提供。

1.3 实验试剂

RPMI-1640培养液(美国Hyclone公司);胎牛血清FBS(美国Hyclone公司);双抗(含青霉素和链霉素各10000 U·mL-1)(吉诺生物医药技术有限公司);二甲基亚砜(DMSO)(美国sigma公司);噻唑蓝(MTT)(美国sigma公司);刀豆蛋白(ConA)(美国sigma公司);脂多糖(LPS)(美国sigma公司);小鼠IL-2细胞因子检测试剂盒(武汉博士德公司，中国);小鼠IL-4细胞因子检测试剂盒(武汉博士德公司，中国);小鼠IL-6细胞因子检测试剂盒(武汉博士德公司，中国);小鼠IFN-γ细胞因子检测试剂盒(武汉博士德公司，中国)。

1.4 仪器与设备

MS204S分析天平(瑞士梅特勒-托利多仪器公司);CKX41倒置显微镜(日本Olympus公司);SW-CJ-2D洁净工作台(苏州苏洁净化设备有限公司);MCO-18M二氧化碳培养箱(日本三洋有限公司);Synergy Mx多功能酶标仪(美国伯腾仪器有限公司);TDL-4台式离心机(上海安亭科学仪器厂)。

2 方法

2.1 试剂的配制

含10%胎牛血清的RPMI1640培养基(完全培养液)：量取89 mL RPMI1640培养基，加入10 mL胎牛血清，再加入1 mL双抗，混合均匀，0.22 μm滤膜过滤除菌，4℃冰箱中保存。

ConA溶液：精密称量ConA 3.5 mg溶于10 mL RPMI1640培养液(不含血清)中，浓度为0.35 mg/mL，0.22 μm滤膜过滤除菌，-20℃冰箱中保存。实验时，10倍稀释为所用浓度。

LPS溶液：精密称量7 mg LPS溶于10 mL不完全RPMI1640培养液(不含血清)中，浓度为0.7 mg/mL，0.22 μm滤膜过滤除菌，-20℃冰箱中保存。实验时，10倍稀释为所用浓度。

2.2 小鼠脾淋巴细胞的制备

参照文献方法[5-6]，取雄性昆明种小鼠，颈椎脱臼法处死，于超净台中无菌取脾脏。将脾脏置于盛有RPMI1640培养基的平皿中剪碎，破碎的脾脏置于200目金属筛网上，用注射器芯研磨透过筛网，完全培养基冲洗，制成脾细胞悬液。1 000 r·min-1离心10 min，加入红细胞裂解液静置3 min，1 000 r·min-1离心10 min以除去血红细胞。RPMI1640培养基洗3次，每次1 000 r·min-1离心10 min，离心弃上清。用RPMI1640完全培养基制成单细胞悬液，计数，调整细胞数为4.8×106个/mL，台盼蓝染液检测细胞的存活率，活细胞比率大于95%即可用于实验。

2.3 商陆多糖对小鼠T、B淋巴细胞增殖的影响

准确称取各多糖样品1～2 mg，溶于适量完全培养基中，浓度为4 mg/mL。使用前分别取适量上述多糖溶液稀释至浓度为5 μg/mL、25 μg/mL和125 μg/mL。将多糖各个浓度100 μL/孔(阳性对照ConA为5 μg/mL，LPS为10 μg/mL)，均设6个复孔，100 μL/孔，加入96孔培养板中，以RPMI-1640对照。每孔加细胞悬液100 μL，置37℃、5% CO2培养48 h，每孔加入5 mg/mL MTT 20 μL，孵育4 h，弃掉上清液，再加入二甲亚砜100 μL，于微量振荡器上缓慢作用10 min，在酶标仪上于490 nm处测吸光度值。

2.4 商陆多糖对小鼠T、B淋巴细胞分泌细胞因子的影响

制备小鼠脾淋巴细胞悬液，调整细胞浓度为5×107个/mL，加入到96孔培养板中，设对照组、商陆总多糖组及均一多糖各组(PAP-X的终浓度为5、25、125 μg/mL)，每一质量浓度4个复孔，置于37℃、含5%的CO2条件下分别培养48 h，收集上清液测定细胞因子含量。

3 实验结果

3.1 商陆多糖对小鼠T、B淋巴细胞增殖的影响

实验结果见表1。由结果可知，商陆总多糖PAP在25 μg/mL、125 μg/mL的浓度下能够显著刺激脾淋巴细胞增殖(P<0.05)。七种商陆均一多糖中，PAP-2、PAP-4、PAP-5、PAP-6及PAP-7对小鼠脾淋巴细胞增殖产生显著的增强作用，而PAP-1、PAP-3的不同浓度对小鼠脾淋巴细胞增殖影响不明显(P>0.05)。

表1 商陆多糖对小鼠T、B淋巴细胞增殖活性的影响

注：与空白组相比，##P<0.01；与模型组相比，*P<0.05，**P<0.01

3.2 商陆多糖对小鼠T、B淋巴细胞分泌的细胞因子的影响

实验结果见表2。从结果可知，与空白组比较，商陆总多糖PAP在25 μg/mL、125 μg/mL的浓度下能够显著刺激脾细胞分泌IL-2、IL-4、IL-6和IFN-γ。七种商陆均一多糖中，PAP-2、PAP-4、PAP-5、PAP-6及PAP-7对小鼠脾细胞分泌细胞因子产生非常显著的增强作用，而不同浓度的PAP-1、PAP-3对小鼠脾淋巴细胞分泌细胞因子影响不显著(P>0.05)。

组别浓度(μg/mL)IL-2(pg/mL)IL-4(pg/mL)IL-6(pg/mL)IFN-γ(pg/mL)空白组—46.33±6.16145.12±16.2592.24±9.9818.99±2.43PAP548.12±7.02147.05±17.3293.12±10.0219.24±3.052552.17±7.52*149.22±16.87102.45±10.14*23.11±3.21*12560.82±7.13**155.21±17.29*134.52±14.13**29.47±4.71**PAP-1545.71±5.42150.24±15.8189.85±8.1018.29±3.562548.23±4.27143.20±17.2795.31±9.0718.33±3.2912549.54±7.14151.03±19.2996.87±10.1119.28±4.41PAP-2545.42±4.05144.21±16.5194.58±9.3220.15±3.152548.51±5.57148.18±15.33105.31±10.07*22.09±2.78*12565.12±5.12**179.21±16.29**121.77±13.24**27.68±3.65**PAP-3546.26±6.20148.17±16.0890.27±8.2416.31±2.412547.03±6.35145.33±19.3692.38±9.3518.57±2.8512549.18±7.25150.23±20.3095.97±11.2519.47±3.54PAP-4547.02±4.24143.89±17.3493.36±9.5718.15±2.042550.25±5.05*146.34±16.67105.31±10.44*19.17±2.5712565.41±6.33**183.21±17.55**117.74±11.54**23.24±3.04*PAP-5548.28±5.57142.47±16.2790.36±9.6818.77±2.562549.32±6.31147.57±15.7899.47±10.55*18.17±2.1412551.14±5.73*194.07±19.45**117.74±11.54**22.14±3.14*PAP-6551.48±5.31*144.27±15.3599.78±9.98*19.07±2.962558.37±6.09**148.10±16.27106.37±11.64**22.17±2.56*12553.14±6.73*152.07±14.45*129.54±12.37**31.47±3.77**PAP-7547.42±5.21147.24±16.0694.78±10.9819.75±2.362550.35±6.21*145.57±15.3795.37±10.5820.09±2.7512564.03±7.52**151.88±15.35*116.37±12.57**25.47±3.57*

注：与空白组相比，*P<0.05，**P<0.01

4 讨论

脾脏是机体最大的免疫器官，是免疫应答和免疫调节的重要器官，是T淋巴细胞和B淋巴细胞的定居场所[7-8]。T淋巴细胞和B淋巴细胞是构成机体免疫器官及系统的基本单位，在免疫应答过程中起核心作用，其增殖是反映细胞免疫最直接的指标[9]。活化的免疫细胞和非免疫细胞经刺激合成、分泌具有多种生物活性的细胞因子，如IL-2、IL-4、IL-6和IFN-γ等是机体免疫调节中重要的调节因子。其中IL-2和IFN-γ主要介导细胞免疫反应，在诱发器官特异性自身免疫、器官移植排斥反应和抗感染免疫中起着重要的免疫调节作用[10]。IL-2是由活化的T细胞产生的一种免疫调节因子，能够促进T淋巴细胞的增殖与分化，具有广谱的免疫增强活性[11]。IL-4又称B细胞生长因子，可增强IgG和IgE水平，也可促进T细胞增殖。IL-6可诱导B细胞分化，还能与IL-1协同促进T细胞增殖[12]。IFN-γ可增强NK细胞和巨噬细胞溶酶体的活力，从而起到免疫调节作用[13-14]。本研究采用小鼠脾细胞进行体外培养，观察商陆均一多糖对小鼠脾细胞增殖的作用。实验结果表明，商陆总多糖以及均一多糖中的PAP-2、PAP-4、PAP-5、PAP-6和PAP-7对小鼠T、B淋巴细胞增殖具有显著的促进作用，并且能够促进细胞因子IL-2，IL-4，IL-6和IFN-γ的分泌。通过本研究，进一步深化了对商陆多糖的免疫调节药效物质基础和功效的认识，为合理开发商陆药材提供理论依据。