健脾解毒中药对肝癌HepG2细胞增殖及PI3K、AKT表达的影响

张斌，徐春江，查芳芳，丁慎华，朱薇珊，钱雪梅

(复旦大学附属中山医院青浦分院，上海 201700)

原发性肝癌(primary liver cancer，PLC)是全球范围内最常见、最致命的肿瘤之一，其发病率和死亡率分别居所有肿瘤的第 7 位和第 4 位[1]，其5 年总生存率仍徘徊在3～5%之间，也是我国发病率较高的恶性肿瘤之一[2-3]。肝癌患者早期往往症状缺乏，许多患者在体检中无意发现，而一旦发现，常常是中晚期，甚至出现多脏器的转移，治疗难度很大，也缺乏特效的药物治疗。目前其发病机制还不十分清楚[4]，多认为与表观遗传改变、染色体改变、等位基因丢失、基因突变以及分子细胞通路的改变等多因素密切相关，因而积极探索肝癌发病机制，并研究早期诊断、预防和治疗方法，是肝癌防治的关键。健脾解毒方由党参、生黄芪及生白术等组成，具有益气健脾、理气解毒等多种作用，在临床运用中显示了较好的抗肿瘤作用，尤其对胃肠道肿瘤及肝癌等有较好的疗效，为探索其机制，我们前期运用健脾解毒中药对二甲基亚硝胺诱导大鼠肝癌模型进行了干预，发现中药有延缓肝癌发病的作用，其机制部分与其下调大鼠肝组织PI3K/AKT信号通路的表达有关[5-6]。为进一步探讨其机制，本研究采用健脾解毒中药药物血清对肝癌HepG2细胞进行干预，以探索健脾解毒中药对肝癌细胞增殖及凋亡的影响，并探索PI3K/AKT信号通路与肝癌发病的相关性，为中药抗肝癌作用提供依据。

1 材料及仪器

1.1 细胞株

中国科学院上海细胞库为本研究提供了肝癌细胞HepG2，采用RPMI 1640进行细胞培养，其培养液中含有100 U/mL青霉素、100 μg/mL链霉素及10%胎牛血清，其中培养箱条件设置为37℃、5%CO2，每隔3～4 d进行传代，选择对数生长期的肝癌细胞用于科研。

1.2 实验大鼠

采用雄性SD大鼠，共20只，平均体质量(100±10)g，购自上海西普尔-必凯实验动物有限公司，饲养于上海中医药大学附属普陀医院实验动物房，该动物房为SPF级别，大鼠采取普通饲料喂养，自由饮水，用于制备药物血清。

1.3 药物

中药方剂由生黄芪、八月札、薏苡仁、野葡萄藤、猪苓、党参、生白术及红藤组成，药物比例10∶10∶10∶8∶10∶5∶5∶8，水煎浓缩成每毫升含生药1.30 g，保存于4℃冰箱中。PI3K抑制剂LY294002(美国Sigma-Aldrich公司)。

1.4 主要试剂

胎牛血清、0.25%胰酶-EDTA 、RPMI 1640培养液及小牛血清等购自Thermo Fisher Scientific公司；Sigma公司提供了二甲基亚砜(DMSO)、四甲基偶氮唑蓝(MTT)及Trizol RNA试剂，上海碧云天生物技术有限公司为本研究提供了鼠抗人SEPP1单克隆抗体及兔抗人GAPDH单克隆抗体。

1.5 仪器设备

96孔培养板购自Nunc公司；电子天平为MettlerToledo公司产品。CO2培养箱购自Binder公司；多功能倒置相差显微镜的型号为(Olympus CK40)，ELX-800全自动酶标仪。

2 方法

2.1 中药药物血清制备

20只大鼠随机分为两组，其中A组：健脾解毒方药物血清组，健脾解毒方按成人体重用药剂量将生药换算为50 g/kg的浓度，连续5 d给大鼠灌胃；B组为空白对照组，采取连续5 d给大鼠灌服等体积的生理盐水。实验前禁食12 h，末次给药后2 h,腹主动脉采血，离心，分离血清，56℃灭活，使用0.22 μm微孔过滤除菌分装，上述血清保存条件为-80℃冰箱。

2.2 细胞培养

采用10%胎牛血清的培养液进行肝癌细胞的培养，培养箱设置为37℃、5%CO2饱和湿度，每2～3 d进行传代，换液48 h后收集细胞用于研究。实验分组如下：①空白对照组；②空白血清组：加入体积分数为10%的空白血清；③中药组(L)：加入体积分数为10%的中药药物血清；④中药组(M)：加入体积分数为15%的中药药物血清；⑤中药组(H):加入体积分数为20%的中药;⑥LY294002组:加入终浓度50 μmol/L的LY294002。

2.3 细胞增殖测定

采取MTT法进行测定，取对数生长期的肝癌细胞接种于96孔培养板中，细胞浓度为1×104，每孔约200 μL。培养24 h后，废弃培养液，重新加入温育液，于培养24 h及48 h时每孔加入20 μL的MTT 液(5 mg/mL)，培养4 h后废弃上清，加入DMSO，采用酶标仪进行测定，取490 nm波长处测量吸光度(OD值)。计算抑制率(%)=(1-用药组平均OD值/对照组平均OD值)×100%。

2.4 细胞凋亡率

收集培养的肝癌细胞，1 000 r/min离心5 min后，废弃上清液，采用PBS进行清洗2次，将缓冲液、AnnexinⅤ-FITC 抗体及PI染液依次加入，在室温下避光放置15 min，送流式细胞仪进行检测。实验重复3次。

2.5 蛋白表达检测

采取Western blot法进行检测，具体参考文献[5]方法进行。重复检测3次。

2.6 数据统计

采用SPSS15.0软件进行统计分析，各组数据采用平均数±标准差(means±sd)进行表示，其中组间比较采用t检验方法，方差分析采用单因素法进行比较，结果按照P<0.05为统计有差异。

3 结果

3.1 健脾解毒中药对肝癌细胞增殖的影响

表1对各组细胞增殖进行了比较，发现LY294002组及各中药剂量组均有显著抑制肝癌细胞增殖的作用，尤其是LY294002及高剂量中药组的抑制作用最大(P<0.01)，其次为中低剂量中药组。表明健脾解毒中药药物血清对肝癌细胞增殖有一定的抑制作用，尤其是中高剂量组抑制作用更加明显。

表1 各组细胞增殖比较

注：与空白对照组比较，*P<0.05，**P<0.01；与LY294002组比较，△△P<0.01

3.2 健脾解毒中药对肝癌细胞凋亡的影响

采用流式细胞仪比较了各组细胞的凋亡率，发现LY294002组及各剂量中药组均有显著促进肝癌细胞凋亡作用，尤其是LY294002组及中高剂量中药组作用最强(P<0.01)，表明健脾解毒中药药物血清对肝癌细胞有促进凋亡作用(见表2及图1)。

表2 各组肝癌细胞凋亡情况比较

注：与空白对照组比较，*P<0.05，**P<0.01；与LY294002组比较，△△P<0.01

注：与空白对照组比较，*P<0.05，**P<0.01图1 各组细胞凋亡率比较

3.3 肝癌细胞AKT、PI3K蛋白表达

采用Western blot对各组肝癌细胞的AKT及PI3K蛋白表达情况进行了比较，发现LY294002组及中高剂量中药组有显著下调AKT及PI3K蛋白表达的作用，而低剂量中药组仅对PI3K有轻度下调，对AKT表达影响不明显(见表3及图2)。上述研究表明健脾解毒中药抑制肝癌细胞增殖可能与下调AKT及PI3K蛋白表达有关。

表3 各组细胞蛋白表达比较

注：与空白对照组比较，*P<0.05，**P<0.01，；与LY294002组比较，△P<0.05,△△P<0.01

注：A.空白对照组；B.空白血清组；C.中药组(L);D.中药组(M);E.中药组(H);F.LY294002组图2 各组细胞蛋白表达情况

4 讨论

肝癌的发生与等位基因丢失、染色体改变、基因突变、表观遗传改变以及分子细胞通路等多因素改变密切相关，其中针对分子细胞通路的研究受到很多学者的高度重视。研究发现，Wnt/β-catenin、RAS和PI3K/AKT/mTOR信号通道与肝癌发病关系密切[7-8]。研究发现，在PI3K/AKT通道中，PI3K是一种脂类激酶，可以催化磷脂酰肌醇D3磷酸化，与细胞异常增殖有关。AKT是一种丝/苏氨酸蛋白激酶，参与细胞增殖的调节、膜蛋白转运、核糖体合成及蛋白质降解等过程，是激活PI3K下游最主要的信号分子[9]，PI3K/AKT通路调控细胞代谢、蛋白合成、细胞增殖与凋亡等重要生理过程[10-13]，共同参与细胞增殖和存活的调节，其异常表达与多种肿瘤发病密切有关，也与肝癌发病密切相关[14-15]。因而该通道受到很多学者的重视，已经针对该通道开发了PI3K抑制剂，AKT抑制剂和mTOR抑制剂等抗肿瘤药物，大大改善了患者的病情发展，有很好的临床运用前景。

中医文献中有“臌胀”“肝积”“瘾瘕”“积聚”“黄疸”“胁痛”等名词的记载都与肝癌相关，中医对肝癌病因病机的认识，包括内因及外因，其中内因主要是劳倦内伤、脾运失健、情志失调、志郁不达及肝失疏泄；外因归为湿热毒邪、内侵肝胆、嗜好烟酒、化湿生热及久蕴生毒。在病机方面认为肝脾肾三脏同病是发病的关键，逐渐出现肝郁脾虚血瘀，造成湿、热、气、血、毒聚结成块，可形成肝积。健脾解毒方为上海中医药大学范忠泽教授的抗肿瘤经验方，经过多年临床研究，认为肝癌发生多由饮食不节(洁)、情志不遂、劳倦等多种因素引起邪毒内生而引起，病机特点是本虚标实，本虚以脾气虚为主，标实为邪毒(热、湿热毒邪)郁肝，治以益气健脾，理气解毒。范教授据此选择了生黄芪、八月札、薏苡仁、野葡萄藤、猪苓、党参、生白术、红藤等进行组方，通过临床运用，发现对包括肝癌、胃肠道肿瘤及肺癌等均有较好效果，目前此方已经获得国家专利。为了探索该方在肝癌防治中的作用机制，我们前期研究发现，该方可以较好的延缓DNE诱导大鼠肝癌的发生和发展，其机制部分与中药调控PI3K/AKT信号通路的表达有关[5-6]。为进一步探索其机制，本课题在前期研究工作基础上，选择人肝癌HepG2细胞开展研究，发现该方有下调PI3K/AKT表达的作用。同时选择PI3K抑制剂LY294002作为对照,发现中药有类似LY294002作用,有抑制肝癌细胞增殖、促进细胞凋亡的作用，有进一步进行临床推广和研究的价值。