虎杖提取物血脂调节作用及其机制研究

赵圣剑,田香霞

(河南中医药大学第三附属医院，河南 郑州 450008)

近年来，随着经济社会发展，人们生活水平提高及生活习惯改善，高脂血症的发生率逐年增加，并呈年轻化趋势，高脂血症与其他心脑血管风险因素相互作用，易导致动脉粥样硬化，增加心脑血管发病率和死亡率[1]。西药虽有很好的降血脂疗效，但会引起胃肠道、肝肾损害等毒副作用[1]。中医认为，血脂异常与肝、脾、肾最为密切，以脾肾虚弱为本，以痰浊、血瘀、气滞为标；在中医理论的指导下，近年来，中药已广泛应用于高血脂症的治疗，具有疗效好、副作用小等优点[2]。虎杖(PolygonumcuspidatumSieb.et Zucc.)是蓼科蓼属Polgohum L.多年生灌木状草本植物，以干燥茎和根入药，味微苦、性寒，归肝、胆、肺经；现代药理研究证实，虎杖提取物具有多种药理作用，包括抗炎、调血脂、抗血栓、抗氧化等[3]。虎杖苷是从虎杖根茎中提取的单体，是白藜芦醇与葡萄糖结合的产物，具有与白藜芦醇相似的药理作用[4]，目前关于虎杖苷的降脂作用研究较少，为了明确虎杖提取物中对调血脂作用的效果及机制，为临床合理应用提供依据，本文研究虎杖提取物对高血脂症大鼠的降血脂作用，并探讨其可能的机制，现报道如下。

1 材料

1.1 药物与试剂

虎杖苷(西安药材公司，产地陕西)；辛伐他汀(杭州默沙东制药有限公司)；胆固醇、胆酸钠均购自湖北鸿运隆生物科技有限公司；总胆固醇(total cholesterol,TC)、甘油三酯(triglyceride,TG)、低密度脂蛋白胆固醇(low density lipoprotein cholesterol,LDL-C)、高密度脂蛋白胆固醇(high density lipoprotein cholesterol,HDL-C)、氧化低密度脂蛋白胆固醇(oxygen low density lipoprotein cholesterol,ox-LDL-C)测定试剂盒均购自上海生工生物工程有限公司；过氧化氢酶(catalase,CAT)、超氧化物歧化酶(superoxide dismutase,SOD)、丙二醛(malondialdehyde,MDA)、一氧化氮(nitric oxide,NO)试剂盒均购自南京建成生物工程研究所；肉碱软脂酰基转移酶-I(carnitine palmitoyltransferase-I，CPT-Ⅰ)、肉碱软脂酰基转移酶-Ⅱ(carnitine palmitoyltransferase-Ⅱ，CPT-Ⅱ)、乙酰CoA羧化酶(acetylcoa carboxylase，ACC)、脂肪酸合成酶(fatty acid synthase,FAS)定量检测试剂盒购自上海江莱生物技术有限公司。

1.2 主要仪器

J-25型高速冷冻离心机(美国贝克曼公司)；7100型全自动生化分析仪(日本日立公司)；S-10高速分散器(宁波新芝生物科技有限公司)；CX21FSIC型显微镜(奥林巴斯公司)。

1.3 实验动物

雄性SD大鼠48只，体质量200～250 g，购自河北省实验动物中心，许可证号SCXK(冀)2003-1-003。适应性喂养1周，喂养环境：温度25℃±5℃，相对湿度50%，12 h昼夜交替。

2 方法

2.1 动物分组及模型建立

所有大鼠均经适应性喂养1周后，随机分为空白对照组、模型对照组、阳性对照组、虎杖提取物组，每组各12只，其中空白对照组大鼠继续喂养普通饲料，其他组大鼠喂养高脂饲料，连续喂养4周后，眼眶取血，3 500 r/min离心15 min，分离得血清，按照试剂盒说明书测定TC和TG，TC和TG升高说明造模成功[5]。从第5周开始阳性对照组大鼠灌胃给予辛伐他汀6 mg/(kg·d)，虎杖提取物组大鼠灌胃给予虎杖苷100 mg/(kg·d)，空白对照组、模型组大鼠灌胃给予蒸馏水，1次/d，连续给药4周。

2.2 指标测定

2.3.1 血脂水平测定

连续给药4周后，眼眶取血，室温静置30 min后，3 500 r/min离心15 min，分离得血清，按照试剂盒说明书操作，采用全自动生化分析仪测定TG、TC、HDL-C、LDL-C、氧化低密度脂蛋白(ox-LDL)。

2.3.2 脂质过氧化指标测定

连续给药4周后，眼眶取血，室温静置30 min后，3 500 r/min离心15 min，分离得血清，按照试剂盒说明书操作，测定一氧化氮(NO)、丙二醛(MDA)浓度，及过氧化氢酶(CAT)、过氧化物歧化酶(SOD)活性。

2.3.3 脂质代谢酶测定

取大鼠肝脏0.1 g，加10倍的4℃缓冲液冰浴匀浆，制成10%匀浆液，4℃下2 000 r/min离心10 min，分离得上清液，-20℃保存待测。按照试剂盒说明书操作，测定CPT-I、CPTII、ACC和FAS水平。

2.3.4 组织形态学及脂联素受体2(adipo R2)免疫组化观察

连续给药4周后，处死大鼠。取大鼠部分肝脏，以4%多聚甲醛液固定，经梯度乙醇脱水，每次30 min，二甲苯透明、石蜡包埋，切成5 μm薄片，45℃烘干，二甲苯脱去石蜡，梯度乙醇(100%、95%、80%、75%)浸泡，每次5 min，蒸馏水浸泡3 min，HE染色10 min，无水乙醇脱水，二甲苯透明，滴加中性树脂，盖上盖玻片封片，光镜下观察，选取不同的视野，观察并拍照。

另取剩余大鼠肝脏制作石蜡切片，石蜡切片置于67℃烘箱中，烘片2 h，脱蜡至水，用pH7.4的PBS冲洗3次，每次3 min。取一定量pH6.0的柠檬酸盐缓冲液，加入微波盒中，微波加热至沸腾，将脱蜡水化后的组织切片置于耐高温塑料切片架上，放入已沸腾的缓冲液中，中档微波处理10 min，取出微波盒流水自然泠却，从缓冲液中取出玻片，先用蒸馏水冲洗两次，之后用PBS冲洗2次,每次3 min。 每张切片加1滴3%过氧化氢溶液，室温下孵育10 min，以阻断内源性过氧化物酶的活性。PBS冲洗3次,每次3 min。最后在显微镜下读片，拍照。

2.3.5 adipo R2 mRNA与PPARα mRNA测定

取肝脏组织0.6 g，采用总RNA提取试剂盒提取肝脏组织总RNA，NAase 37℃消化5 min，反转录试剂盒进行总RNA的反转录，获取得cDNA，荧光定量PCR检测RNA水平的表达，本研究用到的PPARα mRNA及adipo R2 mRNA的引物序列见表1。内参为β-actin。定量PCR检测adipo R2 mRNA及PPARα mRNA的反应条件在94℃ 1 min，95℃ 10 s，55℃ 10 s，72℃ 10 s(40个循环)下进行。adipo R2、PPARα序列及引物均有上海江莱生物技术有限公司购买合成。

表1 adipo R2及PPARα引物信息

2.4 统计学分析

3 结果

3.1 血脂水平

与空白对照比较，模型对照组的TC、TG、LDL-C、ox-LDL表达水平显著升高(P<0.05)，HDL-C表达水平显著降低(P<0.05)。与模型对照组比较，虎杖苷组和阳性对照组TC、TG、LDL-C、ox-LDL表达水平显著降低(P<0.05)，HDL-C表达水平显著升高(P<0.05)，虎杖苷组与阳性对照组无显著性差异(P>0.05)。见表2。

3.2 组织学形态

正常对照组大鼠肝脏被膜光滑，无病变迹象，呈深红色，质韧有弹性。模型对照组大鼠肝脏体积较大，表面暗淡，边缘较圆钝，呈弥漫性淡粉红色，质软。阳性组和虎杖苷组无明显差异。光镜检查可知，正常对照组大鼠肝细胞呈规则六边形，索状分布，胞质均匀，胞核清晰细胞间分界清楚，无病变，无脂肪滴和炎性浸润。模型对照组大鼠肝脏轻微病变，部分细胞呈不规则，肝组织中存在较多脂肪滴。阳性对照组和虎杖苷组大鼠的肝脏脂肪变性程度均轻于模型组，虎杖苷组病变最轻。见图1。

组别TC(mmol/L)TG(mmol/L)LDL-C(mmol/L)HDL-C(mmol/L)ox-LDL(ng/mL)空白对照组1.744±0.390△0.538±0.1000.554±0.0911.403±0.14418.524±6.543模型对照组4.510±0.590△1.940±0.086△1.432±0.113△0.886±0.056△32.371±9.115△阳性对照组2.492±0.321*1.314±0.076*0.803±0.116*1.329±0.167*22.146±6.252*虎杖苷组2.256±0.099*1.253±0.078*0.874±0.046*1.298±0.110*19.613±7.214*

注：与空白对照组相比，△P<0.05；与模型组相比，*P<0.05

图1 各组大鼠肝脏组织学形态图片(×400)

3.3 脂质过氧化酶水平对比

与空白对照组相比，模型对照组大鼠血清中CAT、SOD的活性明显降低(P<0.05)，NO水平显著降低(P<0.05)，MDA的含量显著升高(P<0.05)。与模型对照组相比，阳性对照组和虎杖苷组大鼠血清中CAT、SOD活性显著升高(P<0.05)，NO水平显著升高(P<0.05)，MDA活性显著降低(P<0.05)，且虎杖苷组较阳性对照组改善明显(P<0.05)。见表3。

表3 各组脂质过氧化指标结果比较

注：与空白对照组相比，△P<0.05；与模型组相比，*P<0.05；与阳性对照组相比，☆P<0.05

3.4 肝脏脂质代谢酶水平对比

与空白对照组相比，模型对照组大鼠血清中CPI-I、CPI-II、FAS和ACC表达水平显著升高(P<0.05)，HMGR表达水平显著降低(P<0.05)。与模型对照组相比，阳性对照组和虎杖苷组大鼠血清中CPI-I、CPI-II、FAS和ACC表达均显著降低(P<0.05)，HMGR表达水平显著升高(P<0.05)，且虎杖苷组较阳性对照组改善明显(P<0.05)。见表4。

3.5 adipo R2和PPARα mRNA水平对比及adipo R2免疫组化信息

与模型对照组相比，阳性对照组和虎杖苷组大鼠肝组织中adipo R2 mRNA水平显著提升(P>0.05)，与阳性对照组相比，虎杖苷组大鼠肝组织中PPARαmRNA表达水平均显著升高(P<0.05)，见表5。对比空白对照组、阳性对照组以及虎杖苷组adipo R2免疫组化结果，adipo R2均有广泛表达。

组别CPI-I(pg/mL)CPI-II(pg/mL)FAS(pg/mL)ACC(U/mL)HMGR(pg/mL)空白对照组96.34±1.7893.10±1.9865.99±2.2790.01±2.1975.31±3.16模型对照组145.71±1.23△140.00±2.29△87.63±3.17△145.20±1.51△97.26±5.25△阳性对照组128.59±1.60*119.06±1.54*76.36±2.45*128.69±1.31*87.65±3.54*虎杖提取无组105.43±1.23*☆102.32±1.25*☆69.35±1.52*☆105.38±1.47*☆80.26±2.37*☆

注：与空白对照组相比，△P<0.05；与模型组相比，*P<0.05；与阳性对照组相比，☆P<0.05

图2 三组adipo R2免疫组化图片(×400)

表5 各组adipo R2 mRNA与PPARα mRNA水平结果比较

注：与空白对照组相比，△P<0.05；与模型组相比，*P<0.05；与阳性对照组相比，☆P<0.05

4 讨论

脂类是人体结构和营养的重要物质，其在正常机体内的吸收和代谢维持着平衡状态。但随着人们生活水平提高、生活习惯改变，人们脂类物质的摄入增加，打破了脂质吸收和代谢平衡，导致高血脂症的发病人数逐渐增多。统计数据显示，我国成人高血脂症的患病率为20%，患病人数高达1.6亿人，不仅增加动脉粥样硬化的发生风险，同时也增加了高血压、糖尿病、冠心病等发病风险，增加心脑血管疾病的发病率和死亡率[6]。西药降血脂效果明显，但毒副作用较大，限制其长期的临床应用。因此，发掘祖国传统医药资源，寻找安全、疗效显著的调脂中药具有重要意义。

虽中医学中无高血脂概念，但可用中医血、津、液概括，《灵枢·血络论》中“其血黑以浊”与高血脂症、高黏血症概念极为相近，形象地说明了气血津液代谢失调，破坏“阴平阳秘”动态平衡，以致痰瘀胶结于血脉中的状况[7]。历代医家认为，嗜食肥甘厚味为标，脾肾运化失职为本，二者致气机阻滞，痰瘀内聚，膏脂不归正化，血脂异常多与肝、脾、肾三脏最为密切，以脾肾亏虚、肝失调达为本，以痰浊、血瘀、气滞为标，因此，对该病的治疗主张以调节肝肾亏虚为主[8-9]。虎杖味微苦、性寒，归肝、胆、肺经，广泛应用于心血管疾病的治疗，如虎杖降脂颗粒、血脂宁等方中均含有虎杖，在降血脂方面取得了一定疗效，但关于其主要降脂活性物质及机制的研究较少，虎杖苷是虎杖的主要成分，是白藜芦醇与葡萄糖结合的产物，又称为白藜芦醇苷，而白藜芦醇抗脂质过氧化、降血脂、保护血管等药理作用已被证实。

本文通过喂养高脂饲料建立大鼠高脂血症模型，灌胃给予虎杖苷治疗，结果显示：虎杖苷可以显著降低高脂症大鼠血清中的TC、TG、LDL-C和ox-LDL水平，提高HDL-C水平，提高adipo R2与PPARα表达水平，减小LDL-C/HDL-C比值。血清中TC、TG、LDL-C、HDL-C水平是血脂变化的重要监测指标，TC和TG过高时会导致高胆固醇血症，LDL-C和ox-LDL是导致动脉粥样硬化性脂蛋白，其水平升高会导致心脑血管疾病；HDL-C主要功能是将肝外组织中过多的胆固醇转运到肝脏代谢，减少组织中胆固醇的聚集，可竞争性抑制LDL与内皮细胞受体结合，具有防止动脉粥样硬化、降低冠心病病死率的作用[10-11]，adipo R2为脂联素的受体，脂联素是脂肪细胞分泌的一种内源性生物活性多肽或蛋白质，能预示II型糖尿病和冠心病等的发展。组织学观察发现，虎杖苷组大鼠肝脏脂肪变性程度较模型对照组均显著改善，同时免疫组化结果显示虎杖苷组adipo R2表达程度与空白对照相近，较阳性对照组有很大提高，上述结果说明虎杖苷可以有效降低高脂血症大鼠血脂水平，改善肝脏脂肪变性程度。

本文在研究虎杖苷调节血脂机制过程中发现，虎杖苷可以有效提高高脂血症大鼠血清CAT、MDA和NO水平，下调SOD水平。CAT、MDA、SOD和NO是机体氧化应激的重要因子，氧化应激能够引起细胞膜脂质过氧化，产生丙二醇和β-羟化壬烯，水解B-100，抑制TG向LDL-C转变，抑制肝脏向外输送脂肪酸，造成脂肪堆积[12-13]。CAT主要是催化体内的过氧化氢，使细胞免受过氧化氢的损伤，其水平降低提示机体清除过氧化氢能力降低，增加了细胞被过氧化氢损伤的风险；MDA是脂质代谢的一个最终产物，产生的自由基能够严重的破坏肝细胞膜的结构，导致肝细胞发生肿胀、坏死。SOD能够清除超氧阴离子自由基，减轻和阻断脂质过氧化，对肝细胞有保护作用[14]。上述结果说明虎杖苷可以有效纠正高脂血症大鼠的氧化应激状态，减少脂质过氧化，防止脂肪堆积。

CPT-I、CPI-II是脂肪代谢的限速酶，CPI-I的活性受丙二酰辅酶A调控，是脂肪酸吸收的限速因素[15]。研究表明CPT-I与机体脂肪沉积有一定关系，其表达水平升高有助于增加脂肪酸分解并降低体脂肪的含量[16]。FAS和ACC是肝脏组织脂肪酸合成过程中重要酶，ACC催化乙酰辅酶A羧化成丙二醛辅酶A，FAS催化乙酰辅酶A及丙二醛辅酶A合成长链脂肪酸[17]。本研究发现，虎杖苷可以上调高脂血症大鼠肝脏CPT-I和CPI-II的表达水平，下调FAS和ACC酶水平，说明虎杖苷一方面减少脂肪酸合成，另一方面能促进脂肪氧化分解，从而减少脂肪积累。HMGR是体内催化胆固醇合成的关键酶，通过调节HMGR的活性，可以调节血脂水平[18]。在本次试验中，与对照组相比，各组大鼠肝脏HMGR的表达水平均有下降。与高脂对照组相比，各个剂量组大鼠肝脏HMGR的表达水平均显著降低，说明丹参素对高脂血症大鼠肝脏HMGR的表达有进一步地抑制作用，从而减少胆固醇的合成。adipo R2与PPARα都为体内调节脂联素代谢水平的重要受体，且均与脂联素水平为正相关，结合研究结果虎杖苷可以在基因层面调节受体表达，从而调节降低血脂水平。

综上，虎杖苷可以有效降低高脂血症大鼠的血脂水平，改善肝脏脂肪病变，其机制可能与减少脂肪酸和胆固醇合成，纠正高脂血症大鼠氧化应激状态，从而减少脂质过氧化，防止脂肪堆积。大鼠血浆胆固醇的主要载体为HDL，约占血浆脂蛋白的80%，而人血浆胆固醇的主要载体是LDL，约占血浆脂蛋白的60%，但大鼠具有成本低、易饲养、模型稳定等优点，且大鼠在胆固醇合成、代谢及对膳食胆固醇负荷的反应等方面更接近人类[19]。因此，本文选用大鼠建立高脂血症模型，实验结果具有一定的科学性。