黑芸豆花色苷提取工艺技术研究

竺鉴博，李朝阳，贾鹏禹，李良玉

（1.大庆市萨尔图区政府市场监督局，黑龙江 大庆 163311；2.黑龙江八一农垦大学 国家杂粮工程技术研究中心，黑龙江 大庆 163319）

0 引言

黑芸豆在我国具有悠久的种植和食用历史，中医认为其具有活血利水、抗衰补血、补血安神、补肾益阴、补肝解毒等功效，经现代分析技术检测黑芸豆中含有多种功能性蛋白、多种维生素、大量的不饱和脂肪酸、黄酮苷、花色苷等功能成分[1-2]。目前，对黑芸豆的研究主要集中在芸豆淀粉、黄酮甙、膳食纤维、功能糖、芸豆蛋白氨基酸等方面[3-9]，在黑芸豆花色苷方面的研究还很少，而目前国内外学者已经对表皮颜色较深的黑米、黑豆、红小豆等作物的表皮进行了深入的研究[10-14]，而对芸豆中的红芸豆、黑芸豆、花芸豆等深色种皮芸豆类花色苷的研究较少。以黑龙江特有芸豆品种黑芸豆为原料，进行了黑芸豆花色苷提取工艺的研究，为黑芸豆综合利用提供依据。

1 材料和方法

1.1 材料与试剂

黑芸豆，国家杂粮工程技术研究中心种质资源库提供；其他化学试剂均为分析纯。

1.2 仪器与设备

DR6000型紫外可见光分光光度计、多频多功率超声波处理机、自制制备色谱柱500×1.5 mm、酸度计等。

1.3 试验方法

1.3.1 黑芸豆花色苷的提取工艺

取一定量黑芸豆，精选除杂处理后粉碎过筛进行预处理，加入质量分数为0.6%盐酸，体积分数70%乙醇溶解，超声辅助提取，料液比1∶10（g∶mL），超声频率24 kHz，超声功率300 W，超声时间20 min，超声温度30℃，得到黑芸豆花色苷粗提液[15]。

1.3.2 黑芸豆花色苷光谱特性的测定

将提取后的黑芸豆花色苷溶液在波长200～600 nm内进行全波段扫描，绘制黑芸豆花色苷的光谱特征图，确定最大吸收波长并设定该波长为测定黑芸豆花色苷吸光度的λ值。

1.3.3 单因素试验方法[16]

（1） 乙醇体积分数对黑芸豆花色苷提取的影响。为研究不同乙醇体积分数对提取效果的影响，称取黑芸豆粉10 g，选择20%～100%的9个不同体积分数的乙醇溶液作为提取剂，料液比1∶20（g∶mL），加入0.1%的盐酸溶液调整酸碱度，超声频率24 kHz，超声功率300 W，超声时间25 min，超声温度30℃，每个水平做3个平行样，按照黑芸豆花色苷提取的工艺路线步骤试验，测定吸光度，根据所得数据绘制出黑芸豆花色苷与乙醇体积分数的关系曲线图，分析黑芸豆花色苷吸光度随着乙醇体积分数变化的规律。

（2） 超声温度对黑芸豆花色苷提取的影响。为研究超声温度对提取效果的影响，称取黑芸豆粉10 g，70%乙醇为提取剂，选择20～40℃的5个不同超声温度，料液比1∶20（g∶mL），加入0.1%的盐酸溶液调整酸碱度，超声频率24 kHz，超声功率300 W，超声时间25 min，每个水平做3个平行样，按照黑芸豆花色苷提取的工艺路线步骤试验，测定吸光度，根据所得数据绘制出黑芸豆花色苷与超声温度的关系曲线图，分析黑芸豆花色苷吸光度随着超声温度变化的规律。

（3） 超声时间对黑芸豆花色苷提取的影响。为研究超声时间对提取效果的影响，称取黑芸豆粉10 g，乙醇体积分数 70%为提取剂，选择10～40 min的7个不同超声时间，料液比1∶20（g∶mL），加入质量分数0.1%的盐酸溶液调整酸碱度，超声频率24 kHz，超声功率300 W，超声温度30℃，每个水平做3个平行样，按照黑芸豆花色苷提取的工艺路线步骤试验，测定吸光度，根据所得数据绘制出黑芸豆花色苷与超声时间的关系曲线图，分析黑芸豆花色苷吸光值随着超声时间变化的规律。

（4） 超声功率对黑芸豆花色苷提取的影响。为研究超声功率对提取效果的影响，称取黑芸豆粉10 g，乙醇体积分数70%为提取剂，选择100～500 W的质量分数5个不同处理功率，料液比1∶20（g∶mL），加入0.1%的盐酸溶液调整酸碱度，超声频率24 kHz，超声时间25 min，超声温度30℃，每个水平做3个平行样，按照黑芸豆花色苷提取的工艺路线步骤试验，测定吸光度，根据所得数据绘制出黑芸豆花色苷与超声功率的关系曲线图，分析黑芸豆花色苷吸光度随着超声功率变化的规律。

（5） 料液比对黑芸豆花色苷提取的影响。为研究料液比对提取效果的影响，称取黑芸豆粉10 g，乙醇体积分数70%为提取剂，选择1∶5～1∶25（g∶mL） 的 5个不同处理液料比，加入质量分数0.1%的盐酸溶液调整酸碱度，超声频率24 kHz，超声功率300 W，超声时间25 min，超声温度30℃，每个水平做3个平行样，按照黑芸豆花色苷提取的工艺步骤试验，测定吸光度，根据所得数据绘制出黑芸豆花色苷与料液比的关系曲线图，分析黑芸豆花色苷吸光度随着料液比变化的规律。

1.4 响应面优化试验方法

在上述研究的基础上，采用响应面法优化提取过程，以黑豆花色苷吸光度为Y，分别设置超声功率 （W） 为 X1，超声温度 （℃） 为 X2，超声时间（ min） 为 X3， 料液比 （ g∶mL） 为 X4。

因素水平编码见表1。

表1 因素水平编码

2 结果与分析

2.1 黑芸豆花色苷光谱特性的测定结果

黑芸豆花色苷的紫外-可见光吸收光谱曲线见图1。

图1 黑芸豆花色苷的紫外-可见光吸收光谱曲线

由图1可知，在波长520 nm处有最大吸收峰，选择可见光范围内最大吸收波长520 nm作为吸光度测定波长[17]。

2.2 单因素试验结果与分析

2.2.1 乙醇体积分数对黑芸豆花色苷提取的影响

乙醇体积分数与黑芸豆花色苷提取的关系见图2。

图2 乙醇体积分数与黑芸豆花色苷提取的关系

由图2可知，黑芸豆花色苷的吸光度随着乙醇体积分数的增加不断增大；在70%乙醇体积分数时达到最大之后出现明显下降的趋势。这是可能是由于乙醇体积分数较低时，亲水性的糖类和有机酸等物质的溶解能力强，影响了黑芸豆花色苷的溶出，导致黑芸豆花色苷得率较低；当乙醇体积分数大于70%后，浸提液极性过低，一部分极性相对较强的花色苷不能溶出，导致黑芸豆花色苷得率较低[18-19]。因此，确定黑芸豆花色苷提取的最佳乙醇体积分数为70%。

2.2.2 超声功率对黑芸豆花色苷提取的影响

不同超声功率与黑芸豆花色苷提取的关系见图3。

图3 不同超声功率与黑芸豆花色苷提取的关系

由图3可知，随着超声功率的不断增大，黑芸豆花色苷的OD值呈现上升的趋势；在超声功率为400 W时OD值最大，超过400 W后OD值呈下降的趋势。这是由于随着超声波功率的增加超声波热效应也增加，可能会导致黑芸豆花色苷结构的破坏，从而导致黑芸豆花色苷得率的下降[20]。因此，选择超声功率300～500 W进行进一步的试验。

2.2.3 超声温度对黑芸豆花色苷提取的影响

不同超声温度与黑芸豆花色苷提取的关系见图4。

图4 不同超声温度与黑芸豆花色苷提取的关系

由图4可知，在30℃时，OD值达到最大值，之后不断下降。随着超声温度的升高，溶剂的溶解能力和溶解速度也随之提高，溶剂扩散率和传质效果增加，黑芸豆花色苷分子运动速度也随之提高，在曲线中表现出来的是溶剂和黑芸豆花色苷分子在寻求互相融合的速度及能力的平衡过程，最终到达30℃时二者到达最佳平衡状态[21]。当超声温度超过30℃后，吸光度不断下降，这是由于花色苷自身的热稳定性较差，花色苷类物质遇到高热时结构会发生变化，当转化为查尔酮和甲醇假碱，当条件恢复后这个过程又出现可逆的现象，中间产物一部分还可转变成花色烊阳离子形式[22]。综合考虑后，选择30℃为中心点25～35℃进行响应面试验。

2.2.4 超声时间对黑芸豆花色苷提取的影响

不同超声时间对黑芸豆花色苷提取的影响见图5。

图5 不同超声时间对黑芸豆花色苷提取的影响

由图5可知，超声时间在10～20 min时，吸光度呈现上升趋势，20 min时吸光度最大，20 min后有下降趋势并趋于平缓。随着超声时间的增加其热效应及空化作用增强，导致影响了花色苷的结构稳定性，甚至会导致花色苷类物质的部分降解，破坏黑芸豆花色苷结构，影响其吸光度。因此，试验选择20 min为中心点15～25 min进行响应面试验。

2.2.5 料液比对黑芸豆花色苷提取的影响

不同料液比对黑芸豆花色苷提取的影响见图6。

图6 不同料液比对黑芸豆花色苷提取的影响

由图6可知，在料液比较低时黑芸豆花色苷的吸光度随着料液比的增大不断升高，溶剂较少时很快溶解花色苷迅速溶解，扩散推动力降低，当溶剂量足够大时，对超声波的提取基本无阻碍，OD值逐渐提高；当料液比达到1∶10（g∶mL） 后随着料液比的增加OD值呈现下降趋势，黑芸豆的成分复杂，在溶剂充足的情况下其他成分的溶出增多，从而影响了黑芸豆花色苷的提取[23]。因此，选择料液比1∶5～1∶15（g∶mL） 进行进一步的试验。

2.3 响应面优化试验的结果与分析

基于单因素试验结果，以超声功率（X1），超声温度（X2），超声时间（X3），料液比（X4）为自变量X，以黑芸豆花色苷吸光度为Y，进行响应面试验[24]。

试验安排表和试验结果见表2。

表2 试验安排表和试验结果

对试验结果进行统计分析[25]。

回归方程的方差分析见表3。

由表 3可知，回归模型p＜0.01，而失拟项的p＞0.05，说明该模型拟和结果较好。一次项、二次项p＜0.01，交互项p＜0.05，说明各项均不同程度影响黑芸豆花色苷的吸光度。

二次回归模型参数见表4。

以黑芸豆花色苷的吸光度为Y值，得出X1超声功率，X2超声温度，X3超声时间，X4料液比的X回归方程为：

表4 二次回归模型参数

2.4 交互作用分析

根据回归方程的方程分析结果对交互作用显著的交互项进行交互作用分析，分析交互作用显著的两因素对黑芸豆花色苷提取的影响。图7～图9是SAS8.2软件绘出三维曲面及其等高线图，对这些因素中交互项之间的交互效应进行分析[26]。

Y=f（X1，X4）的响应曲面图及其等高线图见图7。

图7 Y=f（X1，X4）的响应曲面图及其等高线图

由图7可知，响应曲面坡度相对较大，等高线呈椭圆形，表明X1，X4二者交互作用显著。由等高线可知，沿X4方向等高线密集，而X1方向等高线相对稀疏，说明X4相对于X1对响应值峰值的影响大。当 X1在 300～400 W， X4在 1∶5～1∶10（ g∶mL） ，二者存在显著的增效作用，黑芸豆花色苷提取率随2个因素的增加而增加；当X1在400～500 W，X4在1∶10～1∶15（g∶mL），黑芸豆花色苷提取率随2个因素的增加而减小。

Y=f（X2，X3）的响应曲面图及其等高线图见图8。

图8 Y=f（X2，X3）的响应曲面图及其等高线图

由图8可知，响应曲面坡度相对较大，等高线呈椭圆形，表明X2，X3二者交互作用显著。由等高线可知，沿X3方向等高线密集，而X2方向等高线相对稀疏，说明X3相对于X2对响应值峰值的影响大。当 X3在 15～20 min， X2在 25～30℃时， 二者存在显著的增效作用，黑芸豆花色苷提取率随2个因素的增加而增加；当 X3在 20～25 min，X2在 30～35℃内，黑芸豆花色苷提取率随2个因素的增加而减小。

Y=f（X2，X4）的响应曲面图及其等高线图见图9。

由图9可以看出，响应曲面坡度相对较大，等高线呈椭圆形，表明X2，X4两者交互作用显著。由等高线可知，沿X4方向等高线密集，而X2方向等高线相对稀疏，说明X4相对于X2，对响应值峰值的影响大。 当 X2在 25～30 ℃， X4在 1∶5～1∶10（g∶mL） 内，二者存在显著的增效作用，黑芸豆花色苷提取率随 2个因素的增加而增加；当X2在30～35 ℃， X4在 1∶10～1∶15 （g∶mL） ， 黑芸豆花色苷提取率随2个因素的增加而减小。

2.5 最优条件确定

为了进一步确证最佳点的值，采用SAS软件的Rsreg语句对试验模型进行响应面典型分析，以获得最大提取效果时的条件。

图9 Y=f（X2，X4）的响应曲面图及其等高线图

最优提取条件及吸光度见表5。

表5 最优提取条件及吸光度

提取效果最高时的超声功率、超声温度、超声时间、料液比的具体值分别为420 W，29℃，18.7 min，1∶13（g∶mL），该条件下得到的最大吸光度为0.47。验证试验得到黑芸豆花色苷的最大吸光度为0.47±0.05，与理论值非常接近，可以看出建立的模型能够较好地反映出超声波辅助提取黑芸豆花色苷的条件。

3 结论

经过试验得到黑芸豆花色苷的最佳提取工艺参数为超声功率420 W，超声温度29℃，超声时间18.7 min，料液比1∶13（g∶mL），经验证试验，黑芸豆花色苷的最大吸光度为0.47±0.05。提高了黑芸豆花色苷的提取效率，降低了花色苷提取的成本，同时增加了黑芸豆加工的附加值，促进我国黑芸豆生产、加工等相关产业的发展。