水产品中硝基呋喃类代谢物检测方法对比研究

吴亚梅　符云　李绪鹏

摘 要 ：本文对水产品中硝基呋喃类代谢物两种检测方法进行对比研究。就农业部783号公告-1-2006（简称方法1）和GB/T 20752-2006（简称方法2）两种检测方法的线性、检出限、精密度、回收率等方面进行对比试验。结果表明，两种方法AOZ、AHD、AMOZ、SEM在0.5ng/mL-10.00ng/mL同一浓度范围内，线性关系良好，方法1检出限分别为0.010?g/kg、0.014?g/kg、0.021?g/kg、0.017?g/kg，精密度分別为0.67%、0.97%、1.36%、1.12%，平均回收率分別为98.3%、101.7%、96.1%、100.7%;方法2检出限分别为0.035?g/kg、0.10?g/kg、0.058?g/kg、0.054?g/kg，精密度分別为2.35%、7.97%、4.14%、3.65%，平均回收率分別为95.3%、87.7%、87.9%、87.7%。结论，方法1前处理方法简单，检测信号干扰少，检出限、精密度和回收率优于方法2，结果相对更准确可靠，更适用于测定水产品中硝基呋喃类代谢物的含量。

关键词：液相-串联质谱;水产品;硝基呋喃

1  引言

硝基呋喃类药物是一种广谱抗生素[1]，对大多数革兰氏阳性菌和革兰氏阴性菌、真菌和原虫等病原体均有杀灭作用。它们作用于微生物酶系统，抑制乙酰辅酶A，干扰微生物糖类的代谢，从而起抑菌作用。硝基呋喃类药物曾广泛应用于畜禽及水产养殖业，以治疗由大肠杆菌或沙门氏菌所引起的肠炎病、疥疮病、赤鳍病、溃疡病等。由于硝基呋喃类药物及其代谢物对人体有致癌、致畸胎副作用，我国于2002年颁布了禁止使用硝基呋喃类抗生素的禁令[2]。

硝基呋喃类药物常见的有以下4种：呋喃唑酮、呋喃妥因、呋喃它酮、呋喃西林。硝基呋喃类物质均为性质稳定的黄色粉末，无味或味微苦。硝基呋喃类原型药在生物体内代谢迅速，其代谢产物分别为AOZ、AHD、AMOZ、SEM和蛋白质结合而相当稳定，故常利用代谢物的检测来反应硝基呋喃类药物的残留状况[3]。

当前硝基呋喃类药物的检测方法分为四大类[4]：第一类是高效色谱分析法，包括液相色谱-紫外检测器（LC-UV）、液相色谱荧光检测器（LC-FLD）、超高效液相色谱法（UPLC）;第二类是质谱联用分析法，包括液相色谱-质谱（LC-MS）、液相色谱-串联质谱（LC-MS/MS）;第三类是快速检测法，包括酶联免疫吸附分析技术（ELISA）、免疫胶体金技术、化学发光免疫分析法（FI-CL）、荧光免疫法;第四类是光谱分析法。从上可以看出，硝基呋喃原药及其代谢物的检测方法种类繁多，综合当前的研究成果，高效液相-质谱联用技术灵敏度较高，定性定量准确，已成为水产品硝基呋喃类代谢物主要的检测方法。

目前国内颁布了有关硝基呋喃类代谢物的残留检测标准，主要有国家标准[5-7]、检验检疫行业标准[8-9]、农业行业标准[10-12]等。这些标准在实施期间被农业部门、检验检疫系统、进出口企业和其他相关部门广泛采用。

本文以罗非鱼基体以及阳性样品作为实验基体，在日常检测的基础上，对农业部783号公告-1-2006（方法1）和国家标准GB/T 20752-2006（方法2）硝基呋喃类代谢物检测标准进行比较，为动物源性水产品中硝基呋喃类残留检测提供一定的参考。

2 材料与方法

2.1 材料与试剂

样品：本研究中使用的组织样品为实验室中未检出4种硝基呋喃类代谢物的罗非鱼作为阴性样品。

试剂：标准品AOZ、AMOZ、AHD·HCl、SEM·HCl购自德国Dr.Ehrenstorfer公司，纯度均高于98%;同位素内标AOZ-D4、AMOZ-D5、AHD-13C3购自上海安谱、SEM-13C-15N2购自德国Witega公司，纯度均高于98%;甲醇和乙腈为HPLC级（德国默克公司）;乙酸乙酯、二甲亚砜、氢氧化钠、2-硝基苯甲醛和乙酸铵为HPLC级（罗恩试剂）;磷酸氢二钾为分析纯（天津汇杭化工科技）;乙酸为优级纯（广州化学试剂厂）;盐酸为优级纯（上海安谱）;实验用水为超纯水。

2.2 仪器与设备

液相色谱三重四极杆串联质谱联用仪，配ESI离子源（美国-Waters公司）;分析天平（瑞士-梅特勒-托利多）;LXJ-IIB 型离心机（上海安亭科学仪器厂）;涡旋振荡器（德国-海道夫公司）;固相萃取装置（美国-Waters公司）;氮吹仪（美国-ORGANOMATION公司）;恒温振荡器（常州智博瑞）;超纯水机（美国-艾科浦公司）。

2.3 实验方法

2.3.1 标准溶液、混合标准工作溶液、混合内标工作溶液配制

標准溶液配制：称取适量标准品，加甲醇溶解配制成浓度为100μg/mL的标准储备液;移取适量储备液，配制成1μg/mL的混合标准溶液;移取适量混合标准溶液用超纯水稀释，配置混合标准工作溶液，浓度为0.50、1.00、2.00、4.00、6.00、8.00、10.00ng/mL。

内标溶液配制：称取适量内标物，配制成浓度为100μg/mL的内标标准储备液;移取适量内标储备液，配制成1μg/mL的混合内标溶液。将混合内标溶液用超纯水稀释得100 ng/mL的混合内标工作溶液。

2.3.2 样品制备

鱼去鳞，去皮，沿背脊取其肌肉部分，经捣碎机捣碎后，-18℃保存备用。

2.3.3 样品提取与净化

方法1：参照农业部783号公告-1-2006，并适当进行改进。称取样品2.00g于50mL离心管，加入0.05mL混合内标工作溶液，再加入5mL盐酸溶液和0.15mL 2-硝基苯甲醛溶液，涡旋混匀50s后，置于恒温水浴振荡器中37℃ 避光振荡16h。

取出离心管冷却至室温，加入4mL磷酸氢二钾溶液，调节pH至7.4，加入8mL乙酸乙酯，涡旋振荡50s，4000r/min离心10min，转移上层清液至10mL玻璃离心管中，于40℃下氮气吹干。准确加入1.0mL甲醇溶液溶解残留物，过0.45μm 滤膜，待测。

方法2：参照GB/T 20752-2006标准。称取2g均质后的样品于50mL离心管中，加入10mL甲醇-水溶液，均质1min，再用5mL甲醇-水溶液洗涤均质器刀头，二者合并，4000r/min离心5min，弃掉上清液。

取出离心管冷却至室温，加入10mL浓度 0.2mol/L盐酸溶液均质1min，用10mL 浓度0.2mol/L盐酸溶液洗涤均质器刀头，二者合并后加入0.3mL 衍生剂，用液体混匀器混匀，置于37 ℃恒温水浴振荡器避光振荡16h。

上述衍生物溶液放置室温后，加入5mL浓度 0.1mol/L磷酸氢二钾溶液，用浓度1mol/L氢氧化钠溶液调节pH为7.4，4000r/min离心10min，上清液经固相萃取柱過柱，并用5mL乙酸乙酯洗脱，收集洗脱液于25mL棕色离心管中，在40℃ 水浴中用氮气吹干，用样品定容溶液溶解并定容至1.0mL，混匀后过0.2μm 滤膜，待测。

2.3.4 色谱条件

色谱柱：ACQUITY UPLC HSS T3 C18（1.8?m，2.1×100mm）;流速：0.4mL/min;柱温：40℃;进样量：1μL;流动相：0.1%甲酸溶液（含0.5mmol/L乙酸铵）（A相）和0.1%甲酸-乙腈（B相）;流动相梯度条件见表1。

2.3.5 质谱条件

电喷雾离子源：ES+;毛细管电压 （kV） 1.00;锥孔电压（V） 35.00;离子源温度（℃） 120;脱溶剂气温度（℃） 450;脱溶剂气流量（L/Hr） 1000;其他质谱参数见表 2。

3 结果与讨论

3.1 数据的采集

样品经过酸解、衍生化和乙酸乙酯萃取净化，质谱扫描测定，内标法定量。在同等质谱条件下，分别进1μL浓度为10ng/mL的标准溶液，再分别进1μL经过方法（详见2.3.3 样品提取与净化）前处理后的空白样品和加标浓度为2.5μg/kg的加标样品提取液，色谱图见图1-（1-12）、和图2-（1-12）。

3.2 线性关系和检出限

3.2.1 线性关系

本试验按照“2.3实验方法”分别对标准系列工作溶液进行测定，每个浓度点测量1次，将峰面积比值与相应标准溶液质量浓度采用最小二乘法拟合标准曲线，得出测定结果及线性回归方程详见表3。当进样量为1μL时，4种硝基呋喃类代谢物在0.5～10.0ng/mL的质量浓度范围内呈良好的线性关系，相关系数表明，方法1略优于方法2。

3.2.2 检出限

在本试验方法测定条件下，按照信噪比S/N=3所对应浓度为依据计算检出限（LOD），按信噪比S/N=10时的浓度得出定量限（LOQ），结果见表3。方法1降低了溶剂峰和基质的干扰，检出限明显比方法2要低。

3.3 精密度试验

使用阴性样品的罗非鱼作为空白样品，添加2.5μg/kg的水平混合标准溶液，按照“2.3实验方法”分别用方法1和方法2重复测定6次，计算其含量与相对标准偏差（RSD%），数据计算结果见表4。

由表4可见，两种检测方法的RSD均小于10%，均能满足检测需求。

3.4 加标回收率试验

使用阴性样品的罗非鱼肌肉作为空白样品，添加浓度2.5μg/kg的水平混合标准溶液，按照“2.3实验方法”分别用方法1和方法2重复测定6次，分别计算4种硝基呋喃类代谢物的回收率与相对标准偏差（RSD%），数据计算结果见表5。

由表5得出，在相同加标浓度下，方法2除AOZ能达到95.3%，其余各化合物平均回收率均低于88.0%，回收率偏低;方法1在实验分析过程中损失少，平均回收率均大于96%，回收率高，结果更稳定准确。

4 结论

通过对比研究，两种方法线性系数均大于0.998，线性关系良好。方法1各化合物的溶剂峰和基质干扰少，检出限均低于0.021?g/kg，比方法2低约3倍;方法1的回收率均在96.1%以上，且精密度比方法2要高，结果相对稳定准确。当大批量实验时，方法1可以节省大量操作时间和分析时间，实用性强，更适合快速测定水产品中硝基呋喃类代谢物的含量。

参考文献

吴明媛，韦信贤，童桂香，等.水产品组织中硝基呋喃类代谢物残留检测方法优化研究[J]西南农业学报，2016，29（7）：1750-1754

龙顺荣，李炜正，王力清.超高效液相-串联质谱法测定动物组织中硝基呋喃类代谢物残留量[J].食品与机械，2007，23（6）：90-92

王娜，潘治利，凡静云，等.高效液相-串联质谱法测定预出口猪肉中硝基呋喃代谢物[J].食品科学，2008，29（9）：533-537

杨惠宇，张惠峰.水产品中硝基呋喃类药物及其代谢物残留检测技术的研究进展[J].河北渔业，2017，282（6）：49-53

GB/T 20752-2006.猪肉、牛肉、鸡肉、猪肝和水产品中硝基呋喃类代谢物残留量的测定液相色谱-串联质谱法

GB/T 21167-2007.蜂王浆中硝基呋喃类代谢物残留量的测定-液相色谱-串联质谱法

GB/T 21311-2006.动物源食品中硝基呋喃类代谢物残留量检测方法 高效液相色谱-串联质谱法

SN/T 1627-2005.进出口动物源食品中硝基呋喃类代谢物残留量测定方法-高效液相色谱串联质谱法

SN/T 2006-2008.进出口蜂王浆中硝基呋喃类代谢物残留量的测定，液相色谱-质谱/质谱法动物源性食品中硝基呋喃类代谢物残留量的测定-高效液相色谱-串联质谱法. 中华人民共和国国家标准：农业部781号公告-4-2006水产品中硝基呋喃类代谢物残留量的测定-高效液相色谱法.中华人民共和国国家标准：农业部1077号公告-2-2008水产品中硝基呋喃类代谢物残留量的测定-液相色谱-串联质谱法.浙江省地方标准：DB33/T 599-2006