高效液相色谱法测定外科舒筋洗剂中盐酸小檗碱的含量

蔡勇科 吴俊贤 黎晓曲

外科舒筋洗剂在本院沿用有近20年， 是本院制剂中的拳头制剂。该制剂疗效确切， 广泛用于临床， 使用量逐年增长， 得到临床和患者高度的认可， 临床主要用于跌打损伤、劳损、腰颈椎病、骨关节炎以及骨折恢复期等的外洗、熏蒸治疗［1］。其主要由两面针、苏木、黄柏、荆芥、 钩藤、透骨草、威灵仙、千年健、 北刘寄奴、宽筋藤10味中药组成， 具有活血散瘀、舒筋通络作用， 常用来治疗跌打损伤、瘀血等。该制剂现行标准仅对苏木、黄柏进行定性鉴别［2］， 对于其含量检测目前尚无标准， 导致无法全面有效地控制外科舒筋洗剂的质量。黄柏在外科舒筋洗剂处方中为臣药， 盐酸小檗碱为黄柏主要有效成分［3］， 故本文拟探索采用高效液相色谱法建立该制剂中盐酸小檗碱的含量测定方法， 并测定外科舒筋洗剂中盐酸小檗碱的含量［4-6］， 旨在为控制其质量标准提供客观定量的评价方法， 提高该制剂质量标准， 为日常生产提供检验依据， 现具体报告如下。

1 仪器与试剂

1.1 仪器 美国安捷伦公司Agilent-1200型高效液相色谱仪， 包括安捷伦四元泵， 安捷伦在线脱气机， 安捷伦紫外检测器等；安捷伦色谱柱(型号：Eclipse Plus 填料：C18)；德国赛多利期公司CP225D型(0.01 mg/0.1 mg)电子天平， 昆山市超声仪器有限公司KQ-250DA型数控型超声波清洗器(功率250 W， 频率 40 kHz)。

1.2 试剂 乙腈 (色谱纯， TEDIA)， 磷酸二氢钾(广州化学试剂厂20170701-1)， 水为超纯水；盐酸小檗碱对照品(批号：110713-2011814 供含量测定用)购自中国药品生物制品检定所， 含量为86.7%；外科舒筋洗剂(河源市中医院提供3批次：批号 ：181001、181002、181101)。

2 方法与结果

2.1 标准品溶液的配制 对照样品溶液的配制：以电子分析天平称取盐酸小檗碱对照品10.02 mg于100 ml量瓶中, 然后加甲醇溶液将其溶解并稀释至刻度, 作为贮备液, 精密量取贮备液5 ml于25 ml量瓶中, 同样以甲醇溶液稀释至刻度后即为对照样品液；供试品溶液的配制：取外科舒筋洗剂溶液过滤后, 精密量取20 ml, 蒸干, 加甲醇溶液使其溶解(必要时可用超声方法溶解)并转移至50 ml量瓶中, 加甲醇溶液至刻度, 即得供试品溶液；阴性对照品溶液液的配制：按质量标准中规定的处方比例同法配制不含黄柏的阴性样品,按供试品溶液配制方法配制成相应的阴性对照品溶液。

2.2 色谱条件与进样分析 以Agilent Eclipse Plus C18(250.0 mm×4.6 mm， 5 µm)为填充柱 ， 流动相为乙腈 -0.03 mol/L磷酸二氢钾溶液 (28∶72)， 检测波长为 347 nm， 流速为1.0 ml/min， 进样量为10 µl；以峰面积外标法定量。在本色谱条件下， 外科舒筋洗剂中盐酸小檗碱对照品的色谱峰与其他组分峰均取得较好分离， 干扰性较小。

2.3 干扰测试结果 分别取对照品溶液、样品溶液、阴性对照液， 按上述色谱条件进样测绘高效液相色谱法图谱， 组分的出峰时间区域相互分离， 未发现明显干扰峰， 结果表明处方中其他成分及辅料对盐酸小檗碱的测定无干扰作用。见图1。

图1 外科舒筋洗剂高效液相色谱图

2.4 线性关系的考察 分别精密量取盐酸小檗碱对照品储备液 1、3、5、7、9、11 ml， 置于 25 ml量瓶中 ， 通过甲醇定容至要求刻度， 充分摇匀后得到一系列标准溶液。按上述色谱条件分别进样 10 μl， 测定峰面积 ， 以峰面积(A)为纵坐标， 盐酸小檗碱对照品浓度(C)为横坐标绘制标准曲线， 进行线性回归， 计算得回归方程。盐酸小檗碱A=29.63C+45.743(r=0.9912)， 结果表明盐酸小檗碱在3.4749～38.2243 µg范围内与峰面积线性关系良好。

2.5 高效液相色谱法测定方法特性分析 取同一对照品溶液连续重复进样 6 次 ， 进样量 10 µl， 测定峰面积 ， RSD 为0.18%， 结果表明该方法使用的仪器具有良好精密度；取同一批号供试品， 精密量取6份， 按样品测定方法平行测定含量，RSD为0.56%， 结果表明该方法重复性好；取同一样品溶液，在室温放置 ， 分别于 0、2、4、8、12、24 h 测定 1 次 ， 连续测定6次， RSD为0.85%， 样品溶液在24 h内稳定。

2.6 加样回收率试验结果 精密量取已知盐酸小檗碱含量的样品 (批号 ：181001， 盐酸小檗碱含量 ：38.9 µg/ml)10 ml，共6份， 分别加入上述盐酸小檗碱对照品贮备液(盐酸小檗碱 ：86.9 µg/ml)100、200、300 µl， 依法制备供试品溶液 ， 按2.2项下色谱条件测定， 计算回收率。结果显示， 该方法平均回收率为98.06%， RSD为0.93%。见表1。

表1 6份盐酸小檗碱样品加样回收试验结果

2.7 样品盐酸小檗碱含量测定结果 取外科舒筋洗剂3批(批号：181001、181002、181101)进行盐酸小檗碱含量的测定 ， 按 2.1 方法进行配制待测样品液 ， 进样 10 µl， 记录峰面积 ，以外标法计算盐酸小檗碱含量。3批样品盐酸小檗碱含量分别为 38.9、38.8、38.9 µg/ml。见表 2。

表2 3批样品盐酸小檗碱含量测定结果

3 讨论

3.1 指标成分的确定 外科舒筋洗剂为本院院内制剂, 具有活血散瘀、舒筋通络之功效, 临床用来治疗跌打损伤、瘀血等疾病, 临床应用多年, 效果显著。外科舒筋洗剂原标准仅对苏木、黄柏进行定性鉴别, 不符合质量标准提升要求,对其日常生产质量也难于监控。本试验曾经尝试对两面针中氯化两面针碱进行含量［7］测定, 但供试品峰面积偏小, 考虑现有工艺中该成分提取率不高［8］, 故不再选择两面针作为研究对象。黄柏在该制剂处方中为臣药, 其具有清热、消肿、止痛等作用, 与两面针等其他药发挥活血散瘀、舒筋通络止痛之功效。黄柏主要以盐酸小檗碱为主要有效成分［9-15］。在上述试验条件下, 经试验证实, 盐酸盐酸小檗碱试验分离度和重复性较好, 且阴性无干扰, 故选择其为研究对象。

3.2 检测波长的选择 经在线全波长紫外吸收光谱扫描分析, 盐酸小檗碱在265 nm和347 nm波长处有最大吸收波长。若采用265 nm作为检测波长时, 盐酸小檗碱的分离效果较差,分离度达不到要求［16,17］；而采用347 nm作为检测波长时,盐酸小檗碱的分离度好, 峰形良好。且其他物质对测定无干扰。最终采用347 nm作为检测波长。

3.3 提取条件的选择 提取方法可选取甲醇、甲醇-盐酸(100∶1)两种溶剂分别进行提取, 结果并无明显差别, 但从操作方法的简便方面考虑, 选取甲醇提取盐酸小檗碱［18-21］。

3.4 流动相的选择 作者曾对不同流动相体系条件的实验效果分别进行了考察, 分别比较乙腈-0.1%磷酸溶液(每100 ml加十二烷基磺酸钠0.1 g)及乙腈-0.03 mol/L磷酸二氢钾溶液为流动相的效果, 结果表明, 两者结果并无明显差别, 从操作方法的简便及环境保护方面考虑, 选取乙腈-0.03 mol/L磷酸二氢钾溶液作为流动相。

3.5 不同批次样品的含量测定 通过对不同时间生产3批外科舒筋洗剂进行盐酸小檗碱含量的测定, 结果显示差异小, 说明该制剂生产工艺稳定, 在制订内控标准或者提高该制剂标准, 可暂定外科舒筋洗剂的黄柏以盐酸小檗碱计,≥30 µg /ml。

综上所述， 本研究建立测定外科舒筋洗剂中盐酸小檗碱含量方法， 经过方法学验证， 所建立的测定方法符合定量分析要求， 最终确定以347 nm为检测波长， 甲醇为提取液， 乙腈-0.03 mol/L磷酸二氢钾溶液为流动相， 测定结果显示该法简便、准确、快速、分离度好， 重复性好， 干扰小， 可用于外科舒筋洗剂的质量控制。