柴胡总皂苷对小鼠肝脏UGT1A1和SULT1A1活性及其mRNA表达的影响

王永辉，奇锦峰，孙晨

（1. 河南省驻马店市中心医院药学部，河南 驻马店 463000；2. 广州中医药大学中药学院药理学教研室，广东 广州 510006）

中药柴胡为伞形科植物柴胡或狭叶柴胡的干燥根，有解热抗炎、保肝及免疫调节等功效。柴胡皂苷是柴胡的主要成分，目前发现有柴胡皂苷a、柴胡皂苷b1、柴胡皂苷b2、柴胡皂苷c、柴胡皂苷d等[1]。葡萄糖醛酸转移酶（UGT）和硫酸转移酶（SULT）是Ⅱ相代谢酶的主要成员，对很多药物的Ⅱ相代谢具有重要的作用[2]。国外有研究发现十字花科蔬菜（如卷心菜、洋白菜等）中所含的吲哚能增加UGT活性进而促进奥沙西泮和扑热息痛的葡萄糖醛酸反应[6]。柴胡在国内应用广泛，然而柴胡总皂苷对Ⅱ相代谢酶的影响尚无研究报道。本文主要探讨柴胡总皂苷（total saikosaponins，TSS）对小鼠UGT1A1和SULT1A1活性及mRNA表达的影响，为临床相关研究或药物治疗提供参考。

1 实验材料

1.1 动物

NIH小鼠（SPF级），体质量18～26g [广州中医药大学实验动物中心，合格证号SCXK（粤 2008-0020），粤监证号：2008A003]。由实验动物专用饲料喂养。

1.2 试剂

柴胡总皂苷（含量≥85%，昆明科翔生物有限公司）；3’-磷酸腺苷5’-磷酸硫酸（Sigma）；2-萘酚硫酸盐（Sigma）；4-硝基苯酚硫酸盐（Sigma）；Brandford 蛋白定量试剂盒（上海杰美基因有限公司）；RT-PCR试剂（TaKaRa公司）。

1.3 仪器

低温高速离心机（Thermo 电子公司）；G7-953T型组织匀浆机（As One，日本）；紫外分光光度计（尤尼柯上海仪器公司）；实时荧光定量PCR仪（ABI7500，USA）；核酸蛋白检测仪（BIO-RAD Laboratories，USA）。

2 实验方法

2.1 分组与给药

将30只小鼠随机分为3组，雌雄各半。分别为纯水组（10 mL/kg）、柴胡总皂苷（TSS）高、低剂量组（给药剂量分别为150 mg/kg、50 mg/kg）。连续灌胃7 d，每天2次。

2.2 肝微粒体和胞质液制备

小鼠肝脏微粒体和胞浆液的制备依据文献方法进行[3]。最终所得肝微粒体用于测定UGT1A1活性，肝胞浆液测定SULT1A1活性。以Bradford法测定胞浆液和微粒体中的蛋白含量。

2.3 小鼠肝脏UGT1A1活性测定

UGT1A1活性测定依据文献进行[4]，反应体系于540 nm处测吸光度值，以苯胺浓度为横坐标，OD值为纵坐标进行线性回归，得标准曲线：

2.4 小鼠肝脏SULT1A1活性测定

SULT1A1活性测定参考文献方法进行[5]。以4-硝基酚（或2-萘酚）硫酸盐浓度值为横坐标，OD值为纵坐标进行线性回归，得线性回归方程（线性范围0.0625～2.5 μmol/mL）：① 4-硝基酚硫酸盐 ：

② 2-萘酚硫酸盐：

2.5 实时定量PCR分析

小鼠肝脏总RNA提取和RT-PCR反应按试剂盒说明书进行。PCR引物根据文献[6]设计（见表1）。PCR反应每个样品进行3次重复实验，PCR扩增反应条件为：95 ℃预变性30 s，然后进入循环阶段，每个循环包括95 ℃变性15 s，56 ℃退火 30 s，72 ℃延伸 31 s，共 40 个循环。最后以目的基因与GAPDH的含量比值表示目的基因的表达水平，计算供试物组小鼠与纯水组小鼠中目的基因表达水平的比值。

2.6 数据统计分析

采用SPSS 13.0统计软件处理数据，计量资料以“±s”表示，采用t检验，P＜0.05为差异有统计学意义。

3 实验结果

3.1 UGT1A1活性测定

柴胡总皂苷高、低剂量组小鼠肝脏UGT1A1活性与纯水组差异无统计学意义（P＞0.05），提示其对小鼠肝脏UGT1A1活性不具有影响。见表2。

表1 实时荧光定量PCR实验的引物序列

表2 小鼠肝脏UGT1A1活性测定结果

3.2 SULT1A1活性测定

分别以2-萘酚和4-硝基酚为底物测定小鼠肝脏SULT1A1酶活性，柴胡总皂苷高、低剂量组小鼠SULT1A1活性均高于纯水组，差异有统计学意义（P＜0.05）。见表3。

表3 小鼠肝脏SULT1A1 活性测定结果

3.3 小鼠肝脏UGT1A1 mRNA表达

UGT1A1基因表达测定中，柴胡总皂苷高剂量组与纯水组比较差异无统计学意义（P＞0.05），说明TSS对UGT1A1 mRNA的表达没有影响。

图1 各组小鼠肝脏UGT1A1 mRNA表达量的比较

3.4 小鼠肝脏SULT1A1 mRNA表达

SULT1A1基因表达测定中，柴胡总皂苷高剂量组高于纯水组，差异有统计学意义（P＜0.05）。见图2。说明TSS对SULT1A1 mRNA表达有明显的诱导效应。

图2 各组小鼠肝脏SULT1A1 mRNA表达量的比较

4 讨论

UGT1A1在整个UGT家族中具有重要意义，主要参与体内胆红素和部分化合物（酚类、蒽醌类、黄酮类等化合物）的葡萄糖醛酸化反应；SULT1A1主要参与酚类化合物如4-硝基酚、2-萘酚、芳香胺等物质的硫酸化反应。在测定小鼠SULT1A1活性时，本研究分别以4-硝基酚和2-萘酚为底物测定酶活性，使两种底物的测定结果相互验证，增加了检测结果的可靠性。虽然柴胡总皂苷对小鼠肝脏UGT1A1活性没有影响，但对SULT1A1活性的诱导作用、对增加某些药物的硫酸化反应，促进其排泄具有积极意义。

本研究证明柴胡总皂苷对小鼠SULT1A1活性和mRNA表达具有一定的诱导作用，可能促进某些药物在体内的硫酸化反应，因此在临床用药期间应重视柴胡总皂苷对其它合用药物在体内代谢的影响，避免药物之间相互作用。