裕民贝母种子形态休眠解除过程中营养物质的动态变化

朱敏嘉 黄俊华 杨文英

摘要：为掌握裕民贝母种子形态休眠生理因子的响应机制，探讨外源GA3对营养指标的影响，对GA3 0 mg/L和GA3 30 mg/L 这2个处理营养物质的动态变化进行比较。结果显示，种子形态休眠解除过程中：（1）相对含水量和自由水含量增加，束缚水含量减少，细胞代谢能力增强;（2）粗脂肪和淀粉持续降解为可利用的小分子化合物;（3）可溶性糖、可溶性蛋白质以及氨基酸满足前期积累后期消耗的特点，种子首先利用可溶性蛋白质和氨基酸，随后吸收可溶性糖;（4）GA3 30 mg/L处理能增强营养指标活跃程度，并且还可以提前动员氨基酸。

关键词：裕民贝母;种子形态休眠;休眠解除;赤霉素（GA3）;营养物质

中图分类号： Q945.35  文献标志码： A  文章编号：1002-1302（2019）11-0182-04

新疆贝母属资源丰富，种类独特，其中裕民贝母（Fritillaria yuminensis X. Z. Duan）叶形奇特、花色艳丽，作为贝母属中的原始种群[1]，它是唯一开蓝花的贝母[2]，极具观赏价值，以种子和鳞茎繁殖为主[3]。生物碱是衡量植物药用价值的重要标准，裕民贝母鳞茎、叶及茎中均存在生物碱，并且生物碱总量远超疆内其他贝母，说明其药用价值突出[4]。由于裕民贝母的观赏及药用价值备受关注，導致其被过度采挖、数量锐减，因此保护和开发利用该种质资源刻不容缓。采集和研究裕民贝母种子可为野生抚育和人工栽培提供基础材料，这对种质保育、开发利用以及引种驯化具深刻意义。

已有研究表明外源赤霉素（GA3）[5-7]在破除贝母属种子休眠方面颇有成效，前人虽然从可溶性蛋白质角度分析了浙贝母种子休眠特性[8]，但缺乏对裕民贝母种子休眠的生理研究。段咸珍等[9]曾指出裕民贝母种子需完成形态及生理双重后熟才具发芽潜力，根据Baskin等[10-11]对植物休眠的划分，该种子属于形态生理休眠类型。本试验选取裕民贝母种子为研究对象，采用外源GA3打破种子形态休眠，通过分析营养指标的动态变化，阐述种子形态休眠解除过程中营养指标的作用机制。

1 材料与方法

1.1 试验材料

试验用裕民贝母种子于2017年7月采集于新疆维吾尔自治区塔城地区裕民县江克斯乡附近（45°56′～46°10′ N，82°39′～82°67′ E，海拔759～1 080 m）。江克斯乡属于典型的大陆型干旱气候，年平均气温6.5 ℃，年平均无霜期153 d，蒸发量大，降水量少，冬长夏短，冷暖变幅大[12]。

设置GA3 0 mg/L（CK）和GA3 30 mg/L 2个处理。每处理取8 g鲜种子，重复3次，消毒后蒸馏水浸种1 d，次日转入各自GA3溶液浸种3 d，最后置于培养皿中，放入 5/10 ℃ 的RTOP-268Y智能人工气候箱（浙江托普公司）进行暗环境培养。CK处理下种子形态休眠解除需80 d，GA3 30 mg/L 处理仅需60 d。

1.2 试验方法

CK和GA3 30 mg/L处理每隔20 d各取3 g鲜种子进行粗脂肪含量测定，其他指标均取1 g鲜种子，每处理重复3次。其中，水分含量测定采用阿贝折射仪法[13]，粗脂肪含量测定采用索氏提取法[13]，淀粉含量测定采用高氯酸水解法结合蒽酮比色法[13]，可溶性蛋白质含量测定采用考马斯亮蓝法[13]，可溶性糖含量测定采用蒽酮比色法[13]，氨基酸含量测定采用水合茚三酮法[13]。公式如下：

1.3 数据处理

SPSS 18.0软件分析试验数据，Duncans方差分析检验单因素（One-Way ANOVA），Photoshop CS6软件处理图片，Microsoft Excel 2003软件绘制图表。

2 结果与分析

2.1 裕民贝母种子水分的动态变化

裕民贝母种子形态休眠解除过程中，2个处理随时间延长相对含水量缓慢递增，且GA3 30 mg/L处理的相对含水量始终高于CK，但两者相差不大（图1）。0 d时，2个处理相对含水量均为61.77%;20 d时，GA3 30 mg/L处理吸水速度快于CK，2个处理相对含水量急剧增高，CK达72.21%，GA3 30 mg/L 处理达74.36%。40 d时，CK相对含水量的增速略微高于GA3 30 mg/L处理，并且CK相对含水量逐渐追至 74.56%，GA3 30 mg/L处理则缓慢增至75.15%;60 d时，2个处理均保持较低的吸水速率，CK相对含水量攀升至 75.64%，GA3 30 mg/L处理则攀升至76.31%;80 d时，GA3 30 mg/L处理增速再次高于CK，CK相对含水量为78.35%，GA3 30 mg/L处理相对含水量为79.42%。100 d时，2个处理相对含水量最高，GA3 30 mg/L处理以80.78%高出CK处理1.55百分点。

裕民贝母种子形态休眠解除过程中，2个处理随时间延长自由水含量有所提高，且GA3 30 mg/L处理的自由水含量始终高于CK（图2）。0 d时，CK自由水含量为32.44%，GA3 30 mg/L处理自由水含量为34.74%，两者仅相差2.30百分点;20 d 时，CK自由水含量变化不明显，而GA3 30 mg/L处理猛增至50.65%;40 d时，CK自由水含量虽以高于GA3 30 mg/L 处理的增速达到49.74%，但此时GA3 30 mg/L处理已达 62.68%;60 d时，CK仍保持一定增速至自由水含量为 55.01%，但是GA3 30 mg/L处理自由水含量变化不显著;80 d 时，2个处理自由水含量均以较高增速递增，CK为 62.50%，GA3 30 mg/L处理为70.05%;100 d时，CK自由水含量持续升高至66.56%，GA3 30 mg/L处理自由水含量稳定在70.05%，两者差距最小。

裕民贝母种子形态休眠解除过程中，CK处理随时间延长束缚水含量先升后降，GA3 30 mg/L处理处理随时间延长束缚水含量则先降后升，但CK的束缚水含量始终高于GA3 30 mg/L处理（图3）。0 d时，CK束缚水含量为29.34%，GA3 30 mg/L处理束缚水含量为27.03%，两者仅相差2.31百分点;20 d 时，CK束缚水含量升高至37.99%，GA3 30 mg/L处理则下降至23.71%;40 d时，CK束缚水含量开始下降至 24.82%，而GA3 30 mg/L处理减少到12.46%;60 d时，CK束缚水含量持续递减至20.63%，GA3 30 mg/L处理却稳定在11.93%;80 d时，CK束缚水含量以一定减速跌至15.85%，GA3 30 mg/L处理束缚水含量稍微下降至9.36%;100 d时，CK束缚水含量最终低至12.67%，GA3 30 mg/L处理回升到10.71%，两者差距1.96百分点。

2.2 裕民贝母种子粗脂肪的动态变化

裕民贝母种子打破形态休眠期间，2个处理随时间延长粗脂肪含量不断降低，且CK粗脂肪含量始终高于GA3 30 mg/L 处理（图4）。0 d时，2个处理的粗脂肪含量不相上下，CK为1.25%，GA3 30 mg/L处理为1.26%;20 d时，CK粗脂肪含量未發生实质性改变，而GA3 30 mg/L处理稍有回落;40 d时，2个处理的粗脂肪均被迅速分解，CK含量降为 1.00%，GA3 30 mg/L处理则降为0.79%;60 d时，2个处理粗脂肪代谢缓慢，CK仅下降了0.06百分点，GA3 30 mg/L处理则下降了0.08百分点;80 d时，CK粗脂肪以高于GA3 30 mg/L处理的转化率降至0.82%，此时GA3 30 mg/L处理粗脂肪含量为 0.68%;在100 d时，2个处理的粗脂肪含量再次暴跌，CK低至0.51%，GA3 30 mg/L处理低至0.47%。

2.3 裕民贝母种子淀粉的动态变化

裕民贝母种子打破形态休眠期间，2个处理随时间延长淀粉含量整体呈下降趋势，且CK淀粉含量始终高于GA3 30 mg/L 处理（图5）。0 d时，2个处理淀粉含量初始值一致，均为1.00%;20 d时，CK消耗了0.01百分点的淀粉，GA3 30 mg/L 处理则消耗了0.02百分点;40 d时，2个处理的淀粉大量水解，此时CK淀粉含量为0.97%，GA3 30 mg/L处理为0.96%，两者仅相差0.01百分点;相比40 d而言，60 d时两者淀粉含量均减少0.01百分点;80 d时，CK淀粉低至0.95%，GA3 30 mg/L处理低至0.94%;100 d时，2个处理淀粉含量以相同消耗率降至最低值，CK为0.94%，GA3 30 mg/L处理为0.93%。

2.4 裕民贝母种子可溶性糖的动态变化

裕民贝母种子形态破眠阶段，2个处理随时间延长可溶性糖含量前期攀升后期下降，且GA3 30 mg/L处理含量始终高于CK（图6）。0 d时，2个处理可溶性糖含量初始值的差距非常小，CK为0.55%，GA3 30 mg/L处理为0.59%;20 d时，GA3 30 mg/L处理增速高于CK，CK可溶性糖含量升至 0.67%，而GA3 30 mg/L处理升至0.84%;40 d时，两者可溶性糖含量几乎保持相同增率继续上升，此阶段CK含量为 0.75%，GA3 30 mg/L处理则为0.93%;60 d时，两者可溶性糖含量的增速进一步提高，CK含量达1.01%，GA3 30 mg/L处理则达1.21%;80 d时，CK可溶性糖含量高达1.73%，GA3 30 mg/L处理高达1.95%，此后2个处理可溶性糖含量均急剧减少，说明0～80 d裕民贝母种子中的营养物质积累异常活跃;100 d时，2个处理可溶性糖继续降解，说明此时种子开始吸收可溶性糖进行生理活动。

2.5 裕民贝母种子可溶性蛋白质的动态变化

裕民贝母种子形态破眠阶段，可溶性蛋白质含量首先升高然后才下降，并且2个处理在同一时刻达到最大值，仅升降幅度有所变化，上升阶段GA3 30 mg/L处理含量始终大于CK，但下降阶段GA3 30 mg/L处理含量先高于CK随后立即低于CK（图7）。0 d时，2个处理初始值一致;20 d时，CK含量变化不大，GA3 30 mg/L处理则小幅上升;40 d时，2个处理含量激增至最大值;60 d时，2个处理同步下降，此阶段GA3 30 mg/L 处理含量略高于CK;80 d时，2个处理含量进一步下跌，其中GA3 30 mg/L处理降速高于CK，并且GA3 30 mg/L处理含量开始逐步低于CK;100 d时，2个处理含量均最小，但是GA3 30 mg/L处理含量仍低于CK。综上，可溶性蛋白质在0～40 d迅速积累，40～100 d快速降解为胚发育提供能量。

2.6 裕民贝母种子氨基酸的动态变化

裕民贝母种子形态破眠阶段，2个处理随时间延长氨基酸含量变化大致相同，均先升后降，仅峰值时间点有所不同，GA3 30 mg/L处理比CK提前20 d到达峰值，上升阶段GA3 30 mg/L处理氨基酸含量始终高于CK，但下降阶段GA3 30 mg/L 处理氨基酸含量始终低于CK（图8）。0 d时，2个处理初始值相同;20 d时，2个处理含量快速上升，并且GA3 30 mg/L 处理含量高于CK;40 d时，2个处理含量加速提高，GA3 30 mg/L处理含量率先到达顶峰值;60 d时，CK含量继续上升至最高值，与GA3 30 mg/L处理峰值大致相同，但是此时GA3 30 mg/L处理含量开始下降;80 d时，CK含量处于递减阶段，而GA3 30 mg/L处理降速进一步增大;100 d时，2个处理含量均跌落至最低值。

3 讨论

水分作为可以直接参与植物生命活动的关键因子，具有自由水和束缚水2种不同的表达形式，生命体的发育过程以及抗逆性均与自由水和束缚水紧密相关，当自由水含量高时细胞生理活动旺盛并且植物能迅速生长发育，反之植物抗逆性强[14]。植物组织的相对含水量能够反映该组织含水情况，自由水则能够直接参与植物生理活动，而束缚水能够保护细胞弹性和完整性[15]。水分与休眠存在一定联系，当植物组织中的水分减少时，营养物质将过度积累，酶活性也会受到抑制，从而进入休眠状态[16]。本研究表明，裕民贝母种子的相对含水量持续增加，种子已进入休眠解除状态，这一特性与青钱柳[17]相同;自由水含量不断上升，种子中的营养物质被调动，分解转化为可供胚生长利用的可溶性物质，关键酶被激活，从而诱发更好的渗透调节物质;束缚水含量的降低意味着种子当前环境十分良好，不受逆境胁迫;自由水含量多于束缚水，能够保证种子维系正常细胞代谢活动，加速胚的生长发育;GA3 30 mg/L处理下种子的相对含水量、自由水含量自始至终高于CK，但是束缚水含量一直低于CK，推测外源GA3能积极调动细胞内部的生理活动。

脂肪酸及甘油均是脂肪通过脂肪酶水解的产物，它们不仅有利于新细胞的构建，并且脂肪酸可通过氧化磷酸化释放能量供种子生长，而甘油则可直接参与种子糖类代谢活动[18]。粗脂肪作为种子形态休眠解除的启动物质之一，其含量的减少反映出种子代谢活跃，大自然中许多种子存在此类现象，裕民贝母种子亦是如此。整个种子形态破眠中，粗脂肪一直处于消耗状态，并且GA3 30 mg/L处理含量始终低于CK，充分体现了外源GA3分解利用脂肪的能力更强。

淀粉是开启种子生命活动的主要碳源，经淀粉酶催化产生细胞呼吸底料“可溶性糖”供胚利用[19]。裕民贝母种子形态破眠时不断消耗淀粉，导致淀粉含量持续减少，情况与人参属[19]一致;GA3 30 mg/L处理消耗淀粉的能力明显强于CK，彰显了外源GA3可以加速淀粉水解的特点。

可溶性糖作为种子可以吸收利用的小分子化合物，不仅能够参与细胞的呼吸作用，还能够促进胚生长发育，多由淀粉水解产生，或脂肪、蛋白质转化而来[20]。本试验显示，前80 d裕民贝母种子可溶性糖含量不断增加，可能与关键酶活性增强从而导致淀粉、脂肪、蛋白质被加速分解有关;80 d后胚结构日益完整，可溶性糖含量开始减少，与种子相对含水量升高致细胞呼吸作用增强有关，此时种子糖类代谢旺盛[21]。裕民贝母种子可溶性糖前期攀升后期降低的情况与黄精[22]相似，并且GA3 30 mg/L处理可溶性糖含量始终高于CK，凸显出外源GA3能够积累更多的呼吸底物。

可溶性蛋白质作为种子的重要养料以及渗透调节物质，对细胞构建、酶的组成、生物膜透性起至关重要的作用。Horner等[23]曾指出种子中某些细胞在原始蛋白质未被消耗的情况下还会合成新的蛋白质，裕民贝母种子在0～40 d时，可溶性蛋白质含量持续增加，可能与新的蛋白质合成有关，同属植物浙贝母[8]也有类似情况。40 d时，GA3 30 mg/L处理以及CK都是达到峰值后才开始下降，两者动员可溶性蛋白质的时间完全相同;上升阶段GA3 30 mg/L处理含量始终稍高于CK，但下降阶段GA3 30 mg/L处理含量先高于CK随后立即低于CK，综上可知外源GA3有利于可溶性蛋白质的积累与消耗，从而使种子产生更剧烈的生命活动。

氨基酸不仅是种子可吸收的小分子，也是蛋白質的组成单位，同时还是植物内源激素形成的前体，通过参与细胞氮类代谢来调节碳氮平衡，对种子生理具积极作用[24]。裕民贝母种子氨基酸含量表现出先升高后降低的变化趋势，种子前期在积累氨基酸，后期消耗过程中一部分氨基酸被种子直接吸收利用，另一部分用于蛋白质和内源激素的合成，GA3 30 mg/L 处理消耗氨基酸的时间集中在40～100 d，CK则集中在60～100 d。GA3 30 mg/L处理处理下氨基酸含量40 d达到峰值，比CK提前20 d，虽然上升阶段2个处理峰值大致相同，但GA3 30 mg/L处理增速高于CK，这表示GA3 30 mg/L处理不仅利于氨基酸的积累并且能提前动员氨基酸发挥作用;下降阶段GA3 30 mg/L处理氨基酸含量始终低于CK，侧面反映出GA3 30 mg/L处理氮类代谢比CK活跃。

4 结论

随胚逐渐发育完善，种子相对水含量小幅增长，自由水含量显著增多，束缚水含量则相对降低，且束缚水含量低于自由水含量，由此可见水分是保证种子生理活动的关键因子。粗脂肪和淀粉含量自始至终处于下降状态，两者在为胚提供能量时发生了持续性降解，揭示了粗脂肪和淀粉是种子形态破眠期间最先动员的营养物质。可溶性糖、可溶性蛋白质以及氨基酸含量则先升后降，3种物质需要积累到一定程度才能调节种子的生理活动;其中可溶性糖含量前80 d与粗脂肪、淀粉存在一定负向关系，显示出该物质前期积累主要来自粗脂肪和淀粉的降解与转化，后期消耗主要源于种子的呼吸作用;可溶性蛋白质40 d后含量开始减少，该物质主要在种子形态破眠后期提供能量;GA3 30 mg/L处理在40 d时开始启动氨基酸，比CK早20 d，前期该含量增加是为合成相关蛋白质做准备，后期含量减少与参与种子氮类代谢有关。

形态休眠被认为是种子植物中古老且原始的休眠类型[25]，裕民贝母种子存在形态生理休眠，是一种较进化的休眠类型。外源GA3的摄入可以调控营养指标之间的生理作用，从而保证种子的正常生命活动，促进胚外部形态的建成，加速种子形态休眠的解除。本研究仅初步探讨了裕民贝母种子形态休眠期间营养物质的生理变化，关于种子内源抑制物、关键酶、内源激素等生理指标尚未涉及，今后可结合种子生理学、分子生物学进一步系统阐述其种子形态休眠的破除机理，以期为该种子生理休眠研究提供科学参考依据。

参考文献：