2016年北京市朝阳区手足口病相关非EV71非CVA16型肠道病毒病原学特征

宋岩 仲一 付凌姣 王海滨

《手足口病诊疗指南》(2010版)中手足口病(hand-food-mouth disease,HFMD)常规病原学检测只对肠道病毒通用型、肠道病毒71型(enterovirus 71, EV71)和柯萨奇病毒A组l6型(coxsackievirus A16，CVAl6)核酸进行荧光定量PCR检测[1]，对于引起HFMD的其它非EV71非CVA16型肠道病毒(untyped enterovirus, EV-U)型别未做明确鉴定，为全面了解北京市朝阳区肠道病毒的病原构成，对2016年度的EV-U分析报道如下。

1 材料与方法

1.1材料 2016年朝阳区医疗机构的咽拭子或粪便标本；标本采集后，4 ℃暂存，12 h内送达实验室，需长期保存的标本存于-70 ℃冰箱。

1.2方法

1.2.1EV的Real-time PCR检测： 使用Thermo核酸提取仪进行病毒RNA提取，采用上海之江公司EV71型、CVAl6型及肠道病毒通用型核酸联合检测试剂盒进行检测。肠道病毒通用型核酸阳性且EV71型和CVA16型肠道病毒核酸阴性的标本确定为EV-U核酸阳性标本，作为本次的研究对象。

1.2.2非EV71非CVAA16型EV的PCR检测： 参考以往研究[2]，对EV基因组的5’端非编码区(5’UTR)和VP2基因区分别设计特异引物。

1.2.3CVA10的完整VP1基因片段测序及分析： 设计完整VP1基因(894 bp)特异性引物。使用Vector NTI Suite 6和Clustalx软件剪切出完整VP1基因；将本研究的CVA10及来自NCBI数据库的完整VP1基因导入MEGA 6进行聚类分析。

2 结果

2.1EV病原谱结果 检测标本875份，检出592份EV阳性标本：269份CVA16、93份EV71和230份EV-U；230份EV-U阳性标本中确定分型167份：117份CVA6、29份CVA10、16份CVA4、2份CVA12、1份CVA5、1份CVA21和1份CVB4。

2.2非EV71非CVAl 6型EV的时间分布 10月以CVA6为第一优势流行株；4、9、11和12月CVA6超过EV71成为第二优势流行株；1、2月CVA6与EV71并列成为第二优势流行株；CVA6和CVA10分别在11月和6月检出最多。

2.3CVA10的VP1基因序列的聚类分析 本研究对得到的29条CVA10完整VP1区，本地区CVA10的VP1基因核苷酸序列一致性为91.1%～100.0%(均值95.7%)；与CVA10原始株的一致性为76.0%～77.1%(均值76.6%)。根据核苷酸一致性将片段差异度大于15%分为不同基因型(图1)：本地区CVA10为A型，聚为A.1-A.5簇，原始株Kowalik(Genbank序列号AY421767)单独分为B型。本地区19株集中在A.1簇。比较基因簇间一致性，A.1与A.2一致性最高(94.4%%～96.5%，均值95.3%)，A.1与A.5一致性最低(91.1%～93.1%，均值92.6%)。时间分布显示，A.1涵盖了出现CVA10的六个月份：3、4、6-9。

依据地域及时间从NCBI下载国内外CVA10完整VP1基因，包括国内9个地方株，国外5株病毒和原始株，与2016年本地区CVA10的完整VP1基因进行聚类分析。CVA16、EV71和CVA6的原始株VP1基因序列作为外群(图1)。本研究将国内外CVA10聚为5个基因型(A-E)：A型包括3株国外株(俄罗斯、西班牙、越南)和54株国内株(包括29株本地区毒株)，B型由原始株构成，C型包括2株山东株，D型有1株法国株，E型有1株马达加斯加株。A型聚为A.1-A.9簇：A.1簇由本地区19株株、2株福建株和1株湖南株构成，本地区毒株与湖南株核苷酸一致性最高；A.2簇由本地区2株毒株、2株广东株、2株河南株、1株湖南株、1株云南株和1株俄罗斯株构成，本地区毒株与云南株核苷酸一致性最高；A.3簇由本地区3株构成；A.4簇由本地区3株和1株山东株构成；A.5簇由本地区2株和1株越南株构成；A.6簇、A.7簇、A.8簇分别由非本地区的国内12、4、2株构成；A.9簇由1株西班牙株构成。国内毒株集中在A和C基因型，核苷酸序列时间聚类分析显示：C基因型、A.8簇、A.6簇和A.1簇—A.5簇，形成了一个较为完整的时间轴，即2009年以前、2009-2014年和2012-2016年。

注：构建聚类分析图的CVA10VP1序列的检测年份、地点和NCBI序列号如图所示。地区缩写如下：AH-安徽、BJ-北京、FJ-福建、GD-广东、GZ-贵州、HeB-河北、HeN-河南、HuN-湖南、JS-江苏、SD-山东、YN-云南。●代表2016年北京市朝阳区CVA10毒株，○为国外毒株，组外对照为CVA16、EV71和CVA6的原始株。图1 国内外CVA10完整VP1聚类分析图

3 讨论

3.1北京市朝阳区2013年首次出现EV-U超过CVA16和EV71[2]，此次结果显示，EV-U比例稍低于CVA16高于EV71，CVA6的比例高于EV71，这与多个结果一致[3-6]。此次结果显示CVA10为EV-U中仅次于CVA6的优势型别，与该地区2013年的研究一致[2]，而国内部分地区及本地区2012年的研究显示CVA10为EV-U的首位[7-10]，青岛2008年EV-U的优势型别为CVA12[11]。提示国内EV-U的优势型别有时间和地域上的区别。人群感染HFMD相关病毒后只获得长期而牢固的型特异性免疫，因此,优势流行株改变可能引起新一轮HFMD暴发流行。EV71疫苗不具备对EV-U的交叉保护，本研究支持研发以EV71、CVA16及CVA6和CVA10为主要成分的联合疫苗[12]。CVA6有6个月成为第二优势流行株，建议将CVA6纳入日常监测。

3.2通过CVA10的VP1基因聚类分析可以发现：①CVA10在本地区同时存在A.1-A.5基因簇的共循环，A.1簇涵盖了CVA10的整个流行期，对本地区CVA10的流行起关键作用；相比于2009年北京市西城区的分析结果[13]，朝阳区的CVA10型别更为丰富；②CVA10在国内同时存在A和C两种基因型，A型为绝对优势型别，这与LU等[14]研究结果一致；③朝阳区的CVA10在2009-2016年发生了基因簇转换：A.6簇逐渐消失，A.1簇成为主要流行株，这种基因位点变异引起的病毒型别转换有可能引起毒力及亲和力的变化，导致高致病性或高传播力的新型病毒出现。

3.3朝阳区2016年EV-U至少包括CVA6、CVA10、CVA4、CVA12、CVA5、CVA21、CVB4。当多种EV在同一地区共同流行，核酸变异和重组会导致新型病毒出现，进而引发新发传染病流行[15]。加强对HFMD病毒谱日常监测，掌握其生物学特性及流行特征，可为HFMD预警、监控和防治工作提供依据。