铁皮枫斗多糖对小鼠急性酒精性肝损伤的保护作用

罗 群，沈先荣*，侯登勇，何 颖，蒋定文，王庆蓉，陈 伟

（第二军医大学海军医学研究所，上海 200433 ）

肝脏是体内消化、代谢、排泄、解毒和免疫等过程的重要器官[1]，其结构和功能复杂，易受病原体、有毒物质、免疫病理等累及。酒精性肝病（alcoholic liver disease，ALD）是长期大量饮酒所致的肝脏疾病，近年来ALD的发病率呈逐年上升趋势，酒精已成为继病毒性肝炎后导致肝损害的第二大病因[2]。急性酒精性肝损伤是ALD的早期表现，酒精及其代谢产物会引起脂质代谢紊乱、氧化应激及细胞凋亡等，对肝组织造成损害[3-4]。

中草药多糖具有抗氧化功能，可抑制脂质过氧化所致的肝细胞直接损伤，还可以调节脂质代谢、抑制脂肪肝的发生[5-6]。铁皮石斛为兰科植物铁皮石斛的新鲜或干燥茎，鲜铁皮石斛剪去部分须根后，经炒制扭成螺旋形，烘干后成品习称铁皮枫斗。据《中国药典》中记载，“石斛，性寒，味甘、淡、微咸，人胃、肾经，具有益胃生津，滋阴清热的功效”[7]。多糖是铁皮石斛的主要有效成分，能够清除自由基，具有抗氧化活性[8-10]，可以调节机体免疫力[11-12]，防治亚健康，减少疾病的产生，抑制肿瘤，延缓衰老[13-14]。袁慧琦等[15]研究发现铁皮石斛对酒精性肝损伤具有一定的治疗作用，而其作用机制可能是通过上调肝脏组织中凋亡调节蛋白Bcl-2的表达实现。聂春艳等[16]研究表明霍山石斛水溶性多糖可在血清肝功能、脂质代谢以及肝组织酒精代谢酶和抗氧化体系等方面共同干预和恢复酒精性肝损伤。黄静等[17]研究发现霍山石斛多糖对CCl4致小鼠急性肝损伤具有一定的保护作用，其保护机制可能与清除自由基、抑制脂质过氧化、抑制肿瘤坏死因子-α表达有关。本实验通过水提法提取铁皮枫斗多糖，观察其对急性酒精性肝损伤动物的血液及肝组织相关生化指标的影响，并检测肝组织病理变化，研究铁皮枫斗多糖对急性酒精性肝损伤的保护作用。

1 材料与方法

1.1 动物、材料与试剂

雄性ICR小鼠（体质量18～22 g）由上海西普尔-必凯实验动物有限公司提供，动物生产许可证号：SCXK（沪）2013-0016。

铁皮枫斗由上饶致诚实业有限公司提供，经鉴定为兰科植物铁皮石斛的干燥茎。取铁皮枫斗水提物，溶解于蒸馏水中作为受试药，4 ℃冷藏保存。

联苯双酯滴丸（批号13010102，溶解于蒸馏水中作为阳性试剂，4 ℃冷藏保存） 北京协和药厂；谷草转氨酶（aspartate amino transferase，AST）、谷丙转氨酶（aspartate transaminase，ALT）、甘油三酯（triglyceride，TG）、谷胱甘肽过氧化物酶（glutathione peroxidase，GSH-Px）、超氧化物歧化酶（superoxide dismutase，SOD）试剂盒 南京建成科技有限公司。

1.2 仪器与设备

DS-1高速组织捣碎机 上海标本模型厂；旋转蒸发器 上海申胜生物技术有限公司；759型紫外分光光度计、759型紫外-可见分光光度计 上海奥普勒仪器有限公司；酶标仪 美国Thermo公司。

1.3 方法

1.3.1 铁皮枫斗多糖的提取

称取20 g铁皮枫斗，在中药粉碎机中粉碎后，加入装有1 000 mL蒸馏水的圆底烧瓶中，75 ℃水浴中搅拌加热4.5 h，过滤离心除渣后取得水提液。将水提液用盐酸调至pH值为3，利用等电点沉淀法去除杂蛋白，4 ℃静置过夜后，采用500 mL离心管11 680×g离心30 min，取上清液，加入4 倍体积的体积分数95%乙醇溶液，4 ℃静置过夜，再采用500 mL离心管11 680×g离心30 min，得沉淀。在鼓风干燥箱中于40 ℃条件下干燥至恒质量，得到水提固形物3.28 g（白色粉末状），得率为16.4%。采用硫酸-蒽酮比色法测定固形物中的总糖质量分数为81.0%。

1.3.2 动物分组与给药

将小鼠随机分为6 组，每组10 只，设空白对照组、模型组、阳性对照组（灌胃150 mg/kg mb联苯双酯）及铁皮枫斗多糖高、中、低剂量组。高、中、低剂量以《中华人民共和国药典（一部）》石斛干品的人体（体质量以60 kg计）推荐摄入量（6～12 g/d）中值（10 g/d）的5、10、30 倍为依据，计算出每组小鼠的给药剂量。依据小鼠体质量，各剂量组的每日给药量分别为：高剂量组0.05 g/（10 g mb）、中剂量组0.016 7 g/（10 g mb）、低剂量组0.008 3 g/（10 gmb）。石斛多糖组与阳性对照组每日按10 mL/kg剂量灌胃小鼠一次，空白对照组和模型组小鼠给予相同体积蒸馏水，每天灌胃1 次，连续灌胃14 d，按体质量调整灌胃量。末次给药2 h后，除空白对照组外，其余各组按12 mL/kg一次性灌胃体积分数50%乙醇溶液，禁食不禁水，12 h后再灌胃一次，空白对照组给予相应体积蒸馏水，最后一次灌胃后12 h处死小鼠。

1.3.3 血液指标测定

小鼠摘眼球取血，血细胞计数仪测定红细胞（red blood cell，RBC）含量、红细胞比容（hematocrit，HCT）、红细胞平均体积（mean corpuscular volume，MCV）、白细胞（white blood cell，WBC）含量和血红蛋白（hemoglobin，HGB）质量浓度；血液静置后1 040×g离心10 min分离血清，按照试剂盒说明测定血清TG浓度及ALT、AST活力。

1.3.4 肝组织指标测定

取血后处死小鼠，迅速取出肝脏，称质量，测定动物肝脏指数（肝脏指数/（mg/g）＝肝脏质量/mg/体质量/g）；另精确称取小鼠肝脏左叶相同部位组织100 mg，生理盐水制备质量分数10%肝匀浆，530×g低温离心10 min，取上清液，按照试剂盒说明测定肝组织TG浓度、SOD、GSH-Px活力，二喹啉甲酸法测定蛋白含量。

取小鼠肝脏左叶处小块组织，用10%福尔马林试剂固定，常规脱水、石蜡包埋、苏木精-伊红（hematoxylineosin，HE）染色，制成切片，用普通光学显微镜观察肝细胞变性程度、坏死及炎症改变等。

1.4 数据统计分析

实验数据以 ±s表示。组间差异分析采用t检验，P＜0.05表示差异有统计学意义。

2 结果与分析

2.1 对急性酒精性肝损伤小鼠血相指标的影响

表1 铁皮枫斗多糖对急性酒精性肝损伤小鼠血相的影响（n= 10）Table 1 Effects of Dendrobium candidum polysaccharides on hemogram in mice with acute alcoholic liver injury (n= 10)

如表1所示，由于大量摄入酒精后，小鼠发生炎症反应，同时也会发生失水，与空白对照组相比，模型组小鼠血液的红细胞和白细胞含量都显著增高（P＜0.05），给药组中，各剂量组的红细胞含量相对于模型组都显著降低（P＜0.05，P＜0.01），相对于空白对照组无显著性差异；各剂量组白细胞含量相对于模型组都有下降，而中剂量组的白细胞含量相对于模型组显著降低（P＜0.05）。

2.2 对急性酒精性肝损伤小鼠血清指标的影响

脂质过氧化作用是酒精对肝损伤的一种主要方式[18]，大量饮酒会激活氧分子，产生氧化自由基，导致肝细胞膜的脂质过氧化，改变肝细胞膜的结构和功能。ALT和AST是肝细胞内两种重要的转氨酶，小鼠在急性酒精性肝损伤时，肝细胞中的ALT和AST会进入血液中，使血清ALT和AST水平升高[19]。

表2 铁皮枫斗多糖对急性酒精性肝损伤小鼠血清TG、ALT和AST水平的影响（n=10）Table 2 Effects of Dendrobium candidum polysaccharides on the level of TG, ALT and AST in serum of alcohol-treated mice (n= 10)

如表2所示，模型组小鼠血清中TG、ALT、AST的水平都显著高于空白对照组（P＜0.05，P＜0.01），可见，急性酒精性肝损伤模型建模成功。各剂量组小鼠血清中的TG浓度都显著低于模型组（P＜0.05），高剂量组中小鼠血清ALT活力显著低于模型组（P＜0.05），低剂量组中小鼠血清A S T活力显著低于模型组（P＜0.05），实验结果表明铁皮枫斗多糖对急性酒精性肝损伤具有防护作用。

2.3 对急性酒精性肝损伤小鼠肝脏指数的影响

肝脏受到酒精性损伤时会出现肝细胞呈水样变性而肿大；在出现脂质代谢紊乱时，肝细胞内出现脂肪堆积，导致脂肪变性，使肝细胞体积肿大，质量增加；而当肝细胞微管受损，分泌功能障碍时，会导致分泌性蛋白贮留，出现气球样变性，肝脏指数升高。肝脏受到损伤，肝脏指数会发生明显变化，肝脏指数可反映肝脏的病变情况。

表3 铁皮枫斗多糖对急性酒精性肝损伤小鼠肝脏指数的影响（n= 10）Table 3 Effects of Dendrobium candidum polysaccharides on liver index of alcohol-treated mice (n= 10)

如表3所示，模型组小鼠的肝脏指数极显著高于空白对照组（P＜0.01），说明模型组酒精性肝损伤严重，造模成功。各剂量组小鼠的肝脏指数均低于模型组，中剂量组与模型组相比具有显著性差异（P＜0.05）。因此，铁皮枫斗多糖对急性酒精性肝损机体具有一定的防护作用。

2.4 对急性酒精性肝损伤小鼠肝组织指标的影响

乙醇在大量进入机体后，在乙醇脱氢酶的催化下大量脱氢氧化，会抑制肝细胞内脂肪酶活性，引起三羧酸循环障碍，脂肪酸氧化减弱，影响脂肪代谢，导致脂肪在肝细胞内沉积[20]。乙醇在机体中产生过量活性氧会破坏机体的氧化-抗氧化平衡，导致氧化应激，氧化应激使肝细胞内非酶抗氧化物大量消耗，对SOD、GSH-Px等抗氧化酶造成损伤，引起肝细胞膜脂质过氧化反应，损伤肝细胞[21]；因此，肝细胞内TG、SOD、GSH-Px水平可反映酒精性肝损伤程度。

表4 铁皮枫斗多糖对急性酒精性肝损伤小鼠肝组织TG、SOD和GSH-Px水平的影响（n=10）Table 4 Effects of Dendrobium candidum polysaccharides on the level of TG, SOD and GSH-Px of liver tissue of alcohol-treated mice (n= 10)

如表4所示，模型组小鼠肝组织的TG含量显著高于空白对照组（P＜0.05），各剂量组小鼠肝组织的TG含量低于模型组，中、高剂量组与模型组相比具有显著性差异（P＜0.05，P＜0.01）。模型组小鼠肝组织的SOD和GSH-Px活力极显著低于空白对照组（P＜0.01），各剂量组小鼠肝组织SOD和GSH-Px活力高于模型组，中剂量组与模型组相比具有显著性差异（P＜0.05）。

2.5 对急性酒精性肝损伤小鼠肝组织病理变化的影响

如图1所示，在空白对照组中小鼠肝细胞结构及形态正常、排列整齐、分界清楚、大小均匀，细胞核大而圆，核质分布均匀，核仁清晰。模型组小鼠肝细胞普遍浊肿、排列紊乱，出现以肝细胞变性、坏死或细胞核固缩溶解，大量炎性细胞浸润。各剂量组及阳性对照组小鼠肝细胞病理损伤明显减轻，肝细胞排列比较整齐，肝细胞肿胀、变性坏死程度减轻，坏死灶区明显减少，炎性细胞浸润程度也明显较低。

图1 小鼠肝组织病理学显微镜图（200×）Fig. 1 Pathological changes of liver tissues（200 ×）

3 讨 论

过量饮酒已成为世界范围内发病及死亡的重要原因之一，也是导致急性和慢性肝脏疾病的一个主要原因[22-23]。酒精性肝损伤是酒精诱导的以机体肝脏为主要受损靶器官的应激反应，是复杂的病理生理过程[24]。过量饮酒会引起机体酒精代谢酶活性、抗氧化能力和脂质代谢异常，从而导致肝细胞的功能损伤，造成肝细胞内TG大量聚集[25]，SOD和GSH-Px水平下降，膜结构破坏、通透性改变[26]，使得存在于肝细胞内的转氨酶（ALT和AST）从细胞逸出，进入血液循环，此时血清ALT、AST水平较正常生理条件升高[27]，ALT、AST水平是临床医学上检查肝功能的重要指标，常用来判断肝脏是否受到损伤。目前，酒精性肝损伤发病机制尚不完全清晰，尚无公认的有效治疗手段，寻找能够治疗酒精性肝损伤的药物成为研究的一个热点[28-29]。

多糖作为食源性功能因子，是抗酒精性肝损伤的一类重要物质[30]，具有调节脂质代谢和抗氧化功能，能够抑制肝损伤的发生[31-32]。铁皮石斛是一种珍贵的中药材，多糖是铁皮石斛的主要活性成分[33]。铁皮石斛多糖是一种天然乙酰化多糖[34]，具有抗肿瘤、增强免疫力、抗氧化等多种功效。本实验通过灌胃过量酒精诱导小鼠急性肝损伤，检测小鼠血清中的TG、AST、ALT水平及肝组织中的TG、SOD、GSH-Px水平，结果表明，模型组与空白对照组间的各检测指标存在显著性差异（P＜0.05，P＜0.01），因此，急性酒精性肝损伤造模成功。相对于模型组，给药（铁皮枫斗多糖）后小鼠血清和肝组织中的TG浓度显著降低（P＜0.05），说明铁皮枫斗多糖具有改善酒精导致的肝组织脂质代谢异常的作用；同时，中剂量给药组中小鼠肝组织中的SOD和GSH-Px活力显著升高（P＜0.05），因此，铁皮枫斗多糖可有效维持肝组织的抗氧化体系平衡状态，减轻酒精引发的肝组织氧化损伤；小鼠血清中的AST、ALT活力也显著降低（P＜0.05），提示铁皮枫斗多糖可改善肝细胞膜通透性和流动性，减少肝功能损伤。通过肝组织的病理观察发现，给药（铁皮枫斗多糖）后可明显减轻小鼠肝细胞病理损伤。因此铁皮枫斗多糖对酒精致小鼠急性肝损伤有明显的保护作用，在食品保健和治疗药物方面有较广阔的开发前景。