纳豆激酶活性和稳定性的研究进展

于潇潇，杜慧聪，商鹤琴，马领领，李靳影，苑宁

(河北农业大学 理工学院，河北 沧州 061100)

纳豆，是以黄豆为原料经过浸泡、高温蒸煮后与纳豆菌接种培养的一种健康食品，是日本饮食中必不可少的调味品之一，也是日本一种广受人们喜爱的风味物质。其经发酵后大豆中的不溶性蛋白变成可吸收的氨基酸，且含有纳豆激酶、纳豆异黄酮、皂青素、维生素K2等多种功能因子，具有帮助肠胃消化吸收、降低血脂、软化血管、预防高血压及动脉硬化的作用，还兼具缓解骨质疏松、解酒等功效[1]，日常食用可维护人体正常机能。纳豆活性因子中的纳豆激酶是近年来炙手可热的溶血栓类药物，其较高的纤溶活性引起了科学家的广泛关注，但纳豆激酶3D结构极易受外界因素影响[2]，在加工贮藏过程中损耗严重而使纳豆激酶的纤溶作用大大降低，本文归纳了物理、化学、生物三大类因素对纳豆激酶活性及稳定性的影响，旨在为纳豆激酶的研究提供可靠的理论支撑，给纳豆激酶类产品的开发及应用奠定坚实的基础，以寻求更优良的加工工艺及贮存方法。

1 结构和作用机理

1.1 纳豆激酶的结构

纳豆激酶是枯草芽孢杆菌代谢时产生的一种碱性丝氨酸蛋白酶，分子内无二硫键，固体呈白色或淡黄色，可溶于水。纳豆激酶的DNA序列由275个氨基酸残基构成，相对分子质量约为28000 Da，等电点pH为8.6±0.3，该酶的N末端为丙氨酸。NK的3D结构见图1，根据晶体3D结构分析可知，NK含有7个α-螺旋、9个β-折叠和2个Ca2+结合位点(位点A和位点B，2个位点均位于NK球状结构的表面)以及3个Trp、12个Tyr和3个Phe。经研究发现NK的活性中心由催化三联体(Asp32、His64、Ser221)、氧离子洞(Asn155)和底物结合位点(Ser125、Leu126和Gly127)组成，位于NK球状蛋白表面的沟槽内[3]。

图1 纳豆激酶蛋白的3D结构图Fig.1 Three-dimensional structure of nattokinase protein

1.2 纳豆激酶的作用机理

1.2.1 溶栓作用

经研究发现纳豆激酶的溶栓活性是纤溶酶的4倍，溶栓速度是尿激酶的19倍之多。纳豆激酶一方面可水解纤溶蛋白生成小肽和氨基酸直接进行溶栓，另一方面通过穿透肠壁刺激血管内壁产生内源纤溶酶原激活剂，起到双重溶栓作用[4]。纳豆激酶也能将体内的尿激酶原转化为尿激酶[5]，从而激活纤溶酶原产生纤溶酶,增加内源纤溶酶,以溶解血栓。通过降解和失活纤溶酶原激活剂的抑制剂(PAI-1)达到溶栓作用，也是纳豆激酶溶解血栓的一种途径。纳豆激酶溶栓机制见图2，有动物实验研究显示纳豆激酶也可在体外将血栓溶解。

图2 纳豆激酶溶栓机制示意图Fig.2 Schematic diagram of thrombolytic mechanism of nattokinase

1.2.2 降血压

须见洋行博士在1998年的大鼠实验中首次证实纳豆激酶提取物有降血压的功效，Murakami等进一步研究证实具有降血压作用的并非纳豆激酶，而是高温作用后的纳豆激酶酶蛋白裂解产生的小片段肽LY和FY，这两个小片段肽通过抑制血管紧张素转换酶，控制血管收缩和舒张，缓解高血压症状[6]。

1.2.3 降血脂、抗动脉粥样硬化

NK可通过直接抗氧化作用，减少脂质过氧化程度，改善脂质代谢，降低血脂，同时防止动脉粥样硬化现象的发生。Park K J等的动物实验证实NK能显著降低总胆固醇、血清甘油三酯和LDL胆固醇水平[7]。NK通过溶栓作用清除血块，减缓斑块形成的进程；通过降压作用调节血液流通速度；通过降脂作用，防止脂质氧化，从而逆转动脉粥样硬化病变，净化血液环境。也就是说NK抗动脉粥样硬化、改善血液环境的功效是抗血栓、抗凝、抗氧化和降脂的综合作用[8]。

1.2.4 保护神经

人体的多种疾病与淀粉样蛋白有关，比如阿尔茨海默病，纳豆激酶通过溶解淀粉样蛋白延缓老年人脑衰老进程。Hsu等研究发现，除了纤维蛋白，纳豆激酶还可以在中性pH和正常体温下溶解淀粉样蛋白，这一点在最近一项体内和体外模型研究中得到证实，同时数据表明NK兼具蛋白水解、抗炎和抗凋亡的功效，关于更多纳豆激酶对神经类疾病的预防和治疗有待进一步研究[9]。

1.2.5 其他作用

纳豆激酶的抗凝血作用是由于纳豆激酶可以抑制胶原活化血小板中血栓烷B2的形成，在一项NK和阿司匹林抗血小板凝集作用比较的研究中，NK在体内外均显示出优异的抗血小板凝集和溶栓能力，无副作用，可作为阿司匹林类药物的替代品。早先有报道称NK在骨质疏松和糖尿病的预防和治疗中起一定作用，南京医科大学学报中指出纳豆激酶可以诱导玻璃体后部脱离，延缓视网膜中央动脉静脉阻塞，有效改善视网膜功能，可应用于眼部玻璃体溶解术中，目前这些作用机理研究尚未成熟，有待进一步考证。

2 影响NK活性及稳定性的因素

2.1 物理因素

2.1.1 温度

纳豆激酶本质为蛋白质，其活性和稳定性极易受温度的影响，37 ℃以下纳豆激酶的稳定性较好，平均酶活可达到93%，47～60 ℃环境下相对酶活可保持在95%以上，其中55 ℃时酶活达到峰值，高于该温度后，活性随着温度的升高而逐渐降低，当温度超过60 ℃时，纳豆激酶会立即变性失活。由此可见高温对酶活性的影响较大，但低温贮存对于纳豆激酶的品质影响不明显，肖美燕等人在实验中证实反复冻融对纳豆激酶的活性影响不大，反复冻融8次，活力仍达到78%以上，另有报道纳豆激酶在-20 ℃下保存7天，酶活力基本不变，由此可见低温储藏纳豆激酶不失为一种良好的保藏方法[10]。

2.1.2 干燥处理

传统的纳豆食品保质期短，不利于储存食用，将纳豆进行干燥处理可有效延长其货架寿命，减少食用人群对纳豆拉丝的厌恶感，同时营养成分流失较少，对于纳豆食品不失为一种有效的保藏方法。用于保藏食品常见的干燥技术有真空冷冻干燥、喷雾干燥、鼓风干燥、分段联合干燥等[11]。

诸多实验证实真空冷冻干燥可有效地保护纳豆激酶的稳定性和活性，曹峰等通过深入探究冷冻干燥工艺条件得到最优技术，冻干后其酶活高达81.8%[12]。除此之外，在干燥过程中添加保护剂(蔗糖5%、麦芽糊精3%、脱脂乳粉10%、抗坏血酸0.5%)使得纳豆激酶的酶活保持率提高了69.8%，弓玉红等对曹峰的实验进行了优化，得出当用5%甘油、0.5%抗坏血酸、5%柠檬酸钠做保护剂时纳豆激酶酶活更高[13]。但冷冻干燥技术存在能耗大、投入成本过高的弊端，在纳豆制品的干燥制备中较少利用。喷雾干燥技术因干燥效果高，易改变干燥条件且对干燥材料无特殊要求而受到广泛关注，但经处理过的纳豆激酶酶活较冷冻干燥降低约2/5，因此在之后的研究中找寻可提高酶活的保护剂至关重要。鼓风干燥技术经济适用度高但效率低，其中热鼓风干燥对纳豆激酶活性和稳定性的损耗最为严重。近几年分段联合干燥技术的研究方兴未艾，分段联合干燥技术是指根据物料的特性，使用2种及2种以上干燥方式优势互补,分阶段进行的一种复合干燥技术，可使食品良好的风味、色泽及营养物质得以保存，同时减少干燥过程中的能耗，避免了单一干燥方式的缺点。此干燥方法现已被大量应用于果蔬加工中，今后应以纳豆激酶的特性为出发点探究合适的联合干燥技术进一步优化工艺条件，确定出纳豆激酶的最适宜干燥方式，为纳豆激酶类产品货架期的提高提供技术支撑。

2.1.3 物理包埋

物理包埋是一种常用的保藏食品的技术，其原理是将目的物用天然的或者合成的大分子化合物薄膜完全包封，而对目的物的物理化学性质并无损害的技术。孙建华等人利用海藻酸钠、羧甲基纤维素、CaCl2对纳豆激酶进行包埋，使得纳豆激酶的酶活得以保持[14]。另有Dong Xuyan等以卵磷脂、植物甾醇和甘露醇等为辅料及张杰等利用阿拉伯胶和明胶等实现了对NK的有效包埋，且经实验数据可知包封后的纳豆激酶可在高温低pH下维持自身的稳定性和活性[15]。Law D等进一步研究将NK制成片剂后在表面涂上肠溶性的包衣材料，其在400 MPa的压力和极低pH下都不会变性[16]，Wei Xuetuan等用甲基丙烯酸-乙烷基丙烯酸盐共聚物对纳豆激酶进行包埋，使纳豆激酶在酸性条件下被保护而免于变性失活[17]。物理包埋使得纳豆激酶不受外界因素影响且包埋后的NK可以更有效地在小肠当中被利用，这些研究都为纳豆激酶类药物的研发提供可参考的应用实例。

2.2 化学因素

2.2.1 pH

pH对纳豆激酶活性和稳定性的影响研究较为透彻，在pH 7.0～10.0范围内纳豆激酶具有良好的稳定性，当pH<5.0时纳豆激酶极不稳定。pH在7.0～9.0时纳豆激酶活性较高，在pH为8.0时酶活性最高，另有实验指出pH在8.5时酶活最高，可能是因为纳豆激酶纯度或其他条件的影响而稍有偏差。当pH降到7.0以下时，纳豆激酶活性急剧下降，当pH升到10.0以上时，酶活虽有所降低但不明显，证明纳豆激酶在碱性条件下稳定性好，可在碱性条件下进行储存利用。

2.2.2 金属离子

纳豆激酶的活性受多种金属离子的影响,牟小超等通过改良的四肽底物法得到经Ca2+和Tb3+处理的纳豆激酶酶活性得到显著提高，其中Ca2+的效果最好。Cu2+、Co2+和Mn2+产生了不同程度的抑制作用，其中Cu2+作用下的NK只保留了12%的酶活。但实验也同时显示金属离子与NK结合后拥有更好的稳定性，可能是结合后蛋白表面的静电相互作用减小，使得形成更稳定更紧密的结构。另有报道称Hg2+会使纳豆激酶完全丧失活性，而后的实验中发现Fe2+也具有极强的抑制作用；Na+、Cl+等对纳豆激酶活性稳定性几乎无影响，但高浓度的NaCl对纳豆激酶活性有较强的抑制作用。曲涛等利用金属离子对纳豆激酶进行化学修饰，经Mg2+修饰后的纳豆激酶稳定性得到了大幅提高，热稳定性提高了46%，酸碱稳定性提高了51%[18]。在今后纳豆激酶类产品的研究中可适当添加金属离子对产品进行优化，以保证产品在运输、保藏、食用中发挥更好的效力。

2.2.3 保护剂

添加保护剂是现今维持物质活性和稳定性的重要手段，陈晨等将叶酸分子与壳聚糖链键接制备成保护剂后加入纳豆激酶的溶液中，使得纳豆激酶的β-折叠解聚，二级结构以α-螺旋为主，经此转变后的纳豆激酶活性和稳定性都得到了显著提高[19]。Nie等人利用蔗糖酯、羧甲基纤维素钠和明胶作为联合保护剂提高了纳豆激酶乳制品的稳定性[20]。Zhang Shaofei等人用多臂聚乙二醇-聚谷氨酸肽树状大分子作为纳豆激酶保护剂，不仅维持了纳豆激酶的稳定性且活性损失较小。Wu等人将采用发散-收敛法合成的聚赖氨酸树状大分子(PLLD)添加到纳豆激酶中，获得了高达117%酶活的结合体，而且在不同温度和pH下比游离的NK更稳定[21]。另有实验测得牛血清蛋白、海藻酸钠、蛋白胨、甘油、丙二醇、明胶等物质与纳豆激酶混合后，均能提高纳豆激酶的热稳定性，其中添加明胶后酶的稳定性显著提高。关于纳豆激酶保护剂的研究如火如荼，科学家们正致力于调配出能提高纳豆激酶活性并稳定性良好的新型保护剂。

2.2.4 膳食成分

纳豆激酶在低pH下耐受性差，在抵达小肠发挥作用之前会在胃部损失一部分活性，而在进食纳豆激酶时如同时有蛋白质、淀粉、油脂等膳食的参与，会减少纳豆激酶的损失，原因可能是膳食纤维对蛋白的保护作用，例如煮沸的小麦或大米的提取液、肉汤等都能显著提高纳豆激酶的稳定性。张星灿将纳豆激酶与腐乳汤汁共存，得出在香辛料条件下保存70 d相对酶活率仍可保持在73.4%以上，香辛料不仅可以维持纳豆激酶的活性和稳定性，而且消除了NaCl、乙醇对纳豆激酶的抑制作用，证实了纳豆激酶腐乳产品的可行性[22]。今后的研究可通过向片剂或口服液中添加膳食纤维，一方面可增加营养物质的摄入，另一方面可保证纳豆激酶的作用能效。还可将纳豆激酶与常用调味品结合添加其他辅料进行新产品开发，在某种程度上提高了大众对纳豆激酶类产品的可接受度。

2.3 生物因素

2.3.1 基因突变

外界因素对纳豆激酶活性和稳定性的影响归咎于对其结构的影响，通过生物手段诱导纳豆激酶结构变化提高纳豆激酶活性和稳定性的研究近年来如火如荼。刘中美等的实验研究了个别氨基酸突变对纳豆激酶稳定性的影响，结果表明氨基酸位点N76D、P14L突变能提高纳豆激酶的稳定性，但在进一步研究中发现该突变体酶活只有原来的70%[23]。赵菡等将纳豆激酶表面的Asn和Gln突变为Asp和Glu后,得到活性提高为原来1.54倍的突变体Q59E以及热稳定性增强的突变体N218D，其中双突变体Q59E-N218D除热稳定性得到提高外，酶活接近原始酶水平[24]。改组技术是生物诱导基因突变常用的研究技术，蔡永君通过改组技术将纳豆激酶、枯草杆菌蛋白酶等3种酶蛋白编码基因进行重组后转化入大肠杆菌，得到纳豆激酶活性、催化效率均提高2.1倍的突变体[25]。宋文超对先前紫外线诱导酶活提高了258%的纳豆芽孢杆菌BSN-3进行进一步诱导，得到酶活最高的A10-5菌株[26]。基因突变存在着随机性、不定向性、低频性的特点，导致纳豆激酶突变体的活性和稳定性良莠不齐，对纳豆激酶的研究造成严重困扰，研究人员正努力探索酶活更高、稳定性更好的纳豆激酶突变体。

2.3.2 混合菌种发酵

纳豆激酶是大豆发酵后产生的独特功能因子，但因纳豆类似干酪的气味而不受人欢迎，高沛汝尝试将纳豆芽孢杆菌和酿酒酵母进行共发酵，发酵后产物带有淡淡酒香而较容易被接受，且经实验测得纳豆激酶酶活提高了44.48%[27]。彭冬英等人利用纳豆芽孢杆菌与植物乳杆菌混合发酵得到的产物活性较之前提高了64.18%，王瑞珍等将纳豆芽孢杆菌与戴尔凯氏有孢圆酵母混合发酵成功得到了活性提高70.42%的核桃粕发酵品纳豆激酶，同时赋予了更多的营养物质[28，29]。王常苏等将纳豆枯草芽孢杆菌和毛霉混合发酵顺利提高酶活，更值得一提的是发酵后的纳豆产品基本无氨味[30]。高泽鑫等人随后又优化了上述方案，选取纳豆枯草芽孢杆菌BN-05和毛霉菌MS-7共发酵，进一步提高了酶活[31]。沈阳农业大学学报还报道了沼泽红假单胞菌与纳豆芽孢杆菌混合发酵的实例[32]，其发酵后纳豆激酶的稳定性得到了很好的增强。由此可见混合菌种发酵不仅提高了纳豆激酶的稳定性和活性，还改善了传统纳豆发酵品的风味，此外增添了其他营养物质，使纳豆更容易被人们感官所接受，是改良纳豆风味、提高NK酶活增强稳定性的好方法。

3 展望

近年来，血栓疾病严重地威胁着人们的生命健康，因血栓疾病而死亡的人数将近世界总死亡人数的1/4，且数据呈现上升趋势。目前临床所用溶血栓药物存在着出血、给药痛苦等副作用，而且大多数价格昂贵，因此寻求高效、无副作用、价格低廉的新型溶血栓类药物亟待解决。近几年关于纳豆激酶溶血栓作用的研究多不计数，纳豆激酶类保健食品也层出不穷，纳豆激酶可通过多种途径进行高效溶栓，且兼具可口服、安全性高、无副作用、价格低廉和纤溶活力强等优势，目前已有多家公司成功生产上市纳豆激酶类产品。纳豆激酶属于大分子化合物，在保藏过程中极易失去活性，作为溶血栓制剂来说，纳豆激酶在到达作用位点之前必须保持良好的活性和稳定性，目前研究通过筛选纳豆激酶菌种，改进发酵工艺，利用现代基因工程技术和诱变育种技术，对酶活性位点、氨基酸定向进化等手段提高纳豆激酶的活性和稳定性以及产量。在工业化生产中，采用物理包埋、纳米粒子结合以及控制温度、pH、共存物质等工艺对纳豆激酶进行优化，丰富和改良了纳豆产品的保健功效，提升了纳豆激酶作为溶栓剂的开发应用前景，对预防和治疗血管栓塞性疾病具有重大意义。

未来应更重视纳豆激酶类药品和保健品的开发，为广大人们的生命健康保驾护航。