我国不同区域鸡源大肠杆菌的致病性与耐药性状分析

高玉斌,赵 格,邹 明,李月华,赵建梅,刘 坤,盖文艳,王君玮

(1.青岛农业大学动物医学院,山东 青岛 266109;2.中国动物卫生与流行病学中心,农业农村部畜禽产品质量安全风险评估实验室(青岛),山东 青岛 266032)

大肠杆菌为人和动物肠道中存在的共栖菌之一,绝大多数为人类和温血动物肠道中的正常菌群。部分大肠杆菌具有致病性,其中致泻性大肠杆菌根据血清型别、毒力因子和所致症状不同又可分为5种类型：肠致病性大肠杆菌(Enteropathogenic E.coli,EPEC)、肠侵袭型大肠杆菌(Enteroinvasive E.coli,EIEC)、肠凝聚型大肠杆菌(Enteroaggregative E.coli,EAEC)、肠毒素型大肠杆菌(Enterotoxigenic E.coli,ETEC)和肠出血型大肠杆菌(Enterohemorrhagic E.coli,EHEC)[1]。致病性大肠杆菌中有些菌株能引起鸡群发病,导致气囊炎、肝周炎、心包炎或败血症相关综合征,给养殖业带来持续性经济损失。大肠杆菌具有许多毒力因子,其中一些与大肠杆菌致病性有关。ompT是革兰阴性菌表面一种特殊的蛋白。fimC是I型菌毛的重要部分,I型菌毛是鸡源致病性大肠杆菌的重要毒力因子。stx是产致贺菌毒素大肠杆菌重要的毒力因子。iss基因位于大肠杆菌的ColV质粒上,与细菌抗补体作用有关。iutA是气杆菌素的基因之一,被认为是鉴定致病性大肠杆菌的遗传标记。

为了解我国禽源大肠杆菌的致病性和耐药状况分布,对2017年从山东、西藏、云南等7个代表性地区分离获得的发病鸡源大肠杆菌进行了致病类型、毒力因子携带及耐药表型分析,以比较不同家禽养殖地区鸡群发病后分离获得的大肠杆菌的致病性差异和耐药状况,为家禽养殖过程中大肠杆菌病的防治、用药和禽肉蛋产品消费中的大肠杆菌污染风险管控提供基础数据支撑。

1 材料与方法

1.1 菌株来源 2017年从我国7个省(自治区)的部分发病鸡场病死鸡泄殖腔拭子中分离鉴定的大肠杆菌,共130株。其中,吉林20株,山东28株,山西30株,西藏18株,新疆7株,江苏15株,云南12株。上述菌株均由中国动物卫生与流行病学中心动物产品安全监测室保存。大肠杆菌标准菌株(ATCC 25922),购自中国兽医药品监察所。

1.2 主要试剂 Master Mix为美国Promega公司产品;琼脂糖为西班牙Biowest公司产品;Marker-2000,购自宝生物工程(大连)有限公司;三糖铁琼脂,购自北京陸桥生物技术有限责任公司;BIOFOSUN®革兰阴性需氧菌药敏检测板,购自上海星陌生物技术有限公司;五种致病性大肠杆菌多重PCR鉴定试剂盒,由农业农村部畜禽产品质量安全风险评估实验室(青岛)提供。毒力因子PCR引物由青岛擎科梓熙生物技术有限公司合成。

1.3 致病性大肠杆菌的鉴定参照试剂盒说明书进行。 检测的靶基因为eae、stx、est、elt、ipaH、aggR。

1.4 毒力基因检测引物 参考Timothy Johnson等[4]报道的引物序列,选择合成7对用来检测禽源致泻性大肠杆菌的毒力基因引物,分别为iutA、hlyF、iss、iroN、ompT、stx2 和fimC。

1.5 药敏试验 采用微量肉汤稀释法测定15种抗菌药物对分离菌株的最小抑菌浓度(MIC)。参照美国临床实验室标准化委员会(CLSI)标准进行结果判定和质量控制。

15种抗菌药分别是：青霉素类：氨苄西林(AMP)、奥格门丁(A/C)、美罗培南(MEM);头孢类：头孢噻呋(CEF)、头孢他啶(CAZ);氨基糖苷类：庆大霉素(GEM)、大观霉素(SPT);四环素类：四环素(TET)、多西环素(DOX);酰胺醇类：氟苯尼考(FFC);磺胺类：复方新诺明(SXT)、磺胺异噁唑(SF);氟喹诺酮类：恩诺沙星(ENR)、氧氟沙星(OFL);其他：粘杆菌素(CL)。

2 结果

2.1 大肠杆菌致病类型 130株鸡源大肠杆菌参照试剂盒说明书进行检测,5株为致病性大肠杆菌,且均为ETEC类型,占全部分离菌株的3.85%(5/130)。其中,来自山西1株(3.33%,1/30)、山东4株(14.29%,4/28)。PCR扩增结果见图1。

图1 多重PCR鉴定不同致病类型图

2.2 毒力因子检测结果 分离菌株经复苏后,进行ompT、stx2、iss、fimC、iroN、hlyF、iutA7 种毒力基因的PCR检测。来自7个省份的大肠杆菌分离株中,7种毒力基因均有不同程度的检出(见表1),但不同省份分离菌株毒力基因携带种类和比例有较大差异。

7种毒力基因中,iroN基因检出率最高(69.23%,90/130),stx2基因检出率最低(1.54%,2/130)。不同区域菌株中携带的毒力因子种类分布见图2。西藏菌株中只检测出ompT和iroN两种基因,检出率分别为11.11%(2/18)、16.67%(3/18);stx2基因仅在山东菌株中检出,携带比例为7.14%(2/28);iroN基因在山东和新疆分离株中的检出率均为100%,除西藏分离株比例较低外,来自吉林、山西、云南、江苏的分离株中iroN基因的携带率均在55%～60%之间。

表1 不同区域大肠杆菌分离株中毒力因子检出情况 /%

图2 不同地区各毒力因子检出数量及分布

对单株分离菌株的毒力因子携带情况分析表明,含有5种和6种毒力因子的菌株数量最多,分别为 20.77%(27/130)、20%(26/130)。有15.38%(20/130)的菌株不含所测7种毒力因子,未发现同时含有7种毒力因子的分离菌株。不同分离菌株中携带毒力因子的比例见图3。

图3 130个分离株中携带不同毒力因子数量的菌株比例分布

2.3 药敏试验结果 通过对130株鸡源大肠杆菌进行药敏检测,结果表明：菌株对TET耐药率最高(91.54%,119/130),其次是 AMP(90.77%,118/130),对MEM的耐药率最低(12.31%,16/130)。来自不同区域的大肠杆菌分离株对15种药物的耐药检测结果见表2。

表2 不同地区分离菌株的耐药率比较 /%

从分离菌株来源的不同地区看,西藏菌株除对CL耐药率高达95%外,对其他药物的耐药率水平均较低,特别是对GEM和MEM没有耐药性;新疆菌株耐药率相对较高,除A/C和CL外,对其他药物的耐药率均在78%以上;云南菌株虽然对MEM没有耐药性,但对 AMP、TET、SPT、SF、SXT、FFC、ENR和OFL的耐药率均达到100%。从菌株对不同药物的耐药率看,对AMP的耐药率总体较高,除了西藏菌株外,来自其他6省的分离菌株耐药率都在90%以上。不同地区分离株对TET的耐药率均在70%以上。分离菌株对CL和MEM的耐药率相对较低,其中CL除了对来自西藏和云南的菌株耐药较高外,其他均在30%以下;MEM除了新疆菌株外,其他地区菌株最高耐药率仅为16.67%,而来自山西、西藏、云南和江苏的菌株对其均没有耐药性。

多重耐药情况结果显示：鸡源大肠杆菌的多重耐药和交叉耐药情况比较严重,94.62%(123/130)的分离菌株对3种或3种以上的药物耐药,其中最多耐药达到15种药物。耐6～8种药物的分离菌株占83.85%(109/130),菌株多重耐药分布比较见图4。

图4 菌株耐药分布情况

3 讨论

鸡源大肠杆菌中多数为肠道中的正常菌群,但部分大肠杆菌具有致病性,可引起鸡群发病,导致气囊炎、肝周炎、心包炎或败血症相关综合征,给养殖业带来持续性经济损失。有的菌株还可引起人类胃肠炎、泌尿系统感染和脑膜炎等疾患,严重影响公共卫生安全。因此,了解致病性大肠杆菌在我国不同地区的分布情况及其耐药性差异,对合理选择药物、制定有效防治措施具有重要指导作用。从对2017年分离自山东、云南、西藏等7个不同省份的菌株分析情况看,在致病性方面,只有山东、山西鉴定出ETEC,其他省份均没有检测出致病性大肠杆菌,致病性大肠杆菌检出率仅为 3.8%,与LeStrange等[5]所研究的菌株检出率3.6%差异不显著。我国发病鸡源大肠杆菌在致病性方面存在较大的地区性差异。

本研究发现,在跨度较大的7个省份中,只有来自山东的2个分离菌株携带stx2基因,检出率很低,该毒力因子的分布是否与其传播速度的缓慢有关有待于进一步研究。此外,西藏地区分离株检出的毒力因子的种类及数量相较于其他地区分离株均较低,分析可能与西藏地区地处青藏高原,养殖密度较低,菌株进化慢有关。试验结果发现,携带ompT毒力因子的菌株比例(39.23%)与Mohamed等[6]的报道的比例(86.9%)差异比较显著,携带iutA基因的菌株比例(61.54%)与2014年刘红玉等[7]的报道(67.47%)差异不显著。目前致病性大肠杆菌携带有较多的毒力因子,可能与其毒力或者血清型存在一定的关系,需进一步研究。

大肠杆菌病作为兽医临床的常发病,临床上一般首选抗菌药物进行治疗,但长期大量的盲目使用抗菌药物会导致大肠杆菌菌株的耐药率升高[8]。本研究发现,菌株对CL、MEM的耐药率较低,这与Rahmatallah[9]研究的菌株对CL的耐药率2%要高,说明国内对CL仍然存在不合理用药的情况。药敏试验结果表明,菌株对AMP与TET耐药率最高,分别是90.77%、91.54%,这与Halfaoui等报道[10]菌株对TET(94.12%)、AMP(83.01%)的耐药率差异不显著,菌株耐药水平都较高,这可能是因为AMP、TET在临床上的使用时间长有关。西藏地区菌株耐药率较低,可能是由于西藏养殖密度低,药物使用量少、频率低有关。本试验中多重耐药菌株占94.62%,6～8重占主导,这与 Rahmatallah[9]所报道的菌株对多重耐药菌株占97.4%,3重、5重占主导差异显著,由此表明,00不同地区分离菌株对相同的药物耐药率存在明显的差异,这可能与当地临床用药情况相关。随着多重耐药的增加,联合用药的效果也必然越来越差。