水分胁迫对赤霞珠葡萄果实花色苷生物合成的影响

吕丹桂，谢 岳，徐伟荣，王振平

(宁夏大学 农学院，银川 750021)

花色苷是一种水溶性植物色素，属类黄酮的一个亚类，在葡萄果实表皮细胞的细胞质中合成，然后运输到液泡中贮藏[1]。花色苷的质量浓度及组分不仅影响葡萄浆果的成熟度和品质，而且也影响葡萄酒的色泽、风味和营养价值[2-3]。此外，花色苷还具有抗氧化，防治癌症，减轻炎症，抗疲劳等功能[4-5]，广泛用于医药及保健食品中。目前，对葡萄果实花色苷生物合成和果实着色机理的研究已较为清晰，花色苷生物合成分为2个阶段：第1个阶段是苯丙烷类代谢途径，第2个阶段是类黄酮途径[6](图1)，花色苷生物合成由结构基因和调节基因控制[7]，但也受温度、光照，水分及生长调节剂等环境因素的影响[8-10]。

土壤水分质量浓度通过影响葡萄果实类黄酮物质的积累，从而影响葡萄与葡萄酒品质[11]。调亏灌溉(regulated deficit irrigation，RDI)能显著增加葡萄果实花青素和酚类物质浓度，提高果实品质[12]。但目前，对于葡萄水分胁迫的研究主要集中在抗旱指标、光合特性、产量和果实品质等方面[13-14]，而对果实花色苷影响的研究较少。本研究以3 a生酿酒葡萄‘赤霞珠’(VitisviniferaL.Cabernet Sauvignon)为试验材料，在葡萄转色前到成熟期，对其进行不同水分胁迫处理，通过研究不同水分胁迫对葡萄果实总花色苷质量分数以及花色苷合成相关基因表达的影响，分析花色苷合成过程中花色苷与相关基因表达量的关系，阐述水分胁迫对葡萄花色苷的调控机制，以期为酿酒葡萄水分管理及品质提升提供理论依据和技术 指导。

1 材料与方法

1.1 试验材料与设计

试验于2016年4月至9月在宁夏玉泉营农场(38.28°N，106.24°E)国家葡萄产业技术体系水分生理与节水栽培岗位试验基地具有调控温湿度的玻璃温室中进行，以3 a生‘赤霞珠’葡萄(VitisviniferalL.Cabernet Sauvignon)为材料，采用无土限根栽培模式，葡萄种植在长4.0 m，宽0.8 m，高0.5 m的种植槽中，每槽8株，株距50 cm，杯状整形，每株留5～6个结果梢。槽内覆2层华盾PE耐老化(I)型棚膜，填充材料为蛭石、珍珠岩及草炭灰(1∶1 ∶1，V∶V∶V)。槽内采用时控仪控制器进行灌溉，每个槽有2列滴管，间距20 cm，滴管直径2 cm，滴头间距50 cm，流量3.1 L/min，每天8:00统一灌溉，灌溉液为改良霍格兰营养液。

该试验材料2016-05-13为盛花期(full bloom，E-L23)[15]，2016-07-12为转色期(véraison，E-L35)，于2016-07-05果实转色前1周(花后53 d)开始试验处理，通过控制灌溉时间来控制灌水量，以黎明前叶片基础水势(Ψb)值大小反应胁迫程度，根据Bahar等[16]研究，设置4个处理(表1)，每个处理占用3个木槽，即代表3次生物学重复。于2016-07-12(60 d)开始采样，每10 d采样1次，直到2017-09-02(110 d)果实成熟期，在各种植槽的每棵植株上，随机剪取果实，液氮速冻后，-80 ℃超低温冰箱保存，备用。

PAL.苯丙氨酸裂解酶 Phenylalanin ammo-nialyase；C4H.肉桂酸-4-羟化酶 Cinnamic acid -4- hydroxylase；4CL.4-香豆酸-CoA连接酶 4-Coumarate-CoA ligase；CHS.查尔酮合成酶 Chalcone synthase；CHI.查尔酮异构酶 Chalcone isomerase；F3H.黄烷酮3-羟化酶 Flavanone 3-hydroxylase；F3′H.类黄酮3′-羟化酶 Flavanone 3′-hydroxylase；F3′5′H.类黄酮3′5′-羟化酶 Flavanone 3′5′-hydroxylase；DFR.黄烷酮醇4-还原酶 Dihydroflavonol 4-reductase；LDOX.无色花色素双加氧酶 Leucoanthocyanidin dioxygenase；UFGT.类黄酮葡萄糖转移酶 UDP glucose flavonoid glucosyl-transferase;OMT:O-甲基转移酶 O-methyltran-sferase

图1 花色苷生物合成途径[6]
Fig.1 Anthocyanin biosynthesis pathway

1.2 测定项目与方法

1.2.1 葡萄果实品质指标及百粒质量测定 随机取300粒果实称量。可溶性固形物(TSS)质量分数用WYT-32型手持糖量折光仪测定。可滴定酸采用NaOH滴定法测定。单宁采用福林丹尼斯法[17]测定。总酚采用福林酚法[17]测定。

1.2.2 总花色苷质量分数的测定 采用pH示差法[18]测定总花色苷质量分数。

1.2.3 总RNA提取和qRT-PCR 使用北京爱普拜生物有限公司的PEXBIO植物果实总RNA抽提试剂盒提取RNA。使用Takara公司PrimeScriptTM RT reagent Kit with gDNA Eraser (Perfect Real time)试剂盒反转录合成cDNA。内参基因选取Actin和EF。在Genebank中查找得到PAL、 CHS1、 F3′H、 F3′5′H、DFR、UFGT和 MybA1的特异性序列，然后登录http://www.idtdna.com/primerquest/Home/Index进行引物设计，引物由北京奥科鼎盛生物科技有限公司合成(表2)。qRT-PCR反应体系： 2×Ultra SYBR Mixture (CWBIO) 12.5 μL，ddH2O 9.5 μL，模板2 μL，引物1 μL(上游引物和下游引物各0.5 μL)。qRT-PCR反应程序： 95 ℃10 min，95 ℃ 15 s，60 ℃ 1 min，40个循环， 72 ℃熔解扩增产物7 min。所有样品都设置3个重复，用ddH2O代替cDNA作为NTC对照。采用2-ΔΔCt法对数据进行计算[19]。

表1 不同处理叶片基础水势及日灌水量Table 1 Basic water potential and daily irrigation of different treatments

表2 实时荧光定量PCR引物序列Table 2 Primer sequences for real-time quantitative PCR

1.3 数据处理

用Microsoft office excel 2013绘图；采用Sigmaplot 12.5进行数据处理，用LSD法进行One Way ANOVO分析。

2 结果与分析

2.1 不同水分胁迫处理对采收期葡萄果实组分的影响

由表3可知，T3百粒质量显著低于CK，且T1、T2和T3较CK分别降低1.5%、11.1%和25.9%，表明葡萄果实百粒质量随水分胁迫程度的增加而降低，过度胁迫可抑制果实生长。T1和T2的可溶性固形物质量分数显著高于CK，分别比CK高9.3%和5.7%；T3则低于CK，表明轻度和中度水分胁迫可提高果实TSS质量分数。T1和T2的可滴定酸(TA)质量浓度低于CK，表明轻度和中度水分胁迫会降低TA的质量浓度，而T3极显著高于CK，说明重度水分胁迫提高了TA质量浓度。单宁和总酚的质量分数均为T1显著高于CK，分别较CK增加了27.7%和 35.8%，而T2与CK差异不显著，T3的单宁和总酚质量分数则低于CK，表明轻度水分胁迫有利于单宁和总酚的积累，而重度水分胁迫抑制了单宁和总酚的积累。

处 理Treatment百粒质量/gHundred grain mass可溶性固形物/%Total soluble solid可滴定酸/(g/L)Titratable acid 单宁/(mg/g)Tannins总酚/(mg/g)Total phenolsCK142.69±0.14 Aa20.53±0.42 ABb3.75±0.11 Bb1.48±0.03 Ab2.12±0.05 ABbT1140.49±0.16 Aab22.66±0.57 Aa3.56±0.13 Bb1.89±0.07 Aa2.88±0.07 AaT2126.84±0.33 Aab21.71±0.16 Aab3.19±0.09 Bc1.66±0.05 Aab1.97±0.12 ABbcT3105.79±0.37 Ab17.31±0.32 Bc4.50±0.04 Aa1.34±0.09 Ab1.78±0.05 Bc

注：同列不同小写字母表示差异达到0.05显著水平，不同大写字母表示差异达到0.01显著水平。

Note:Different lowercase letters in each column mean significant different at 0.05 level,different capitals mean significant different at 0.01 level.

2.2 水分胁迫对葡萄果实总花色苷质量分数的影响

葡萄果实总花色苷质量分数随着葡萄果实的成熟呈上升趋势(图2)。不同水分胁迫处理对总花色苷质量分数的影响不同。从70 d至110 d，T1和T2总花色苷质量分数均高于CK，在110 d达到最大，且显著高于CK，分别为0.241%和 0.288%，T3除在70 d和80 d高于CK外，而其余时间均低于CK，表明轻度和中度水分胁迫能增加果实总花色苷质量分数，短期的重度胁迫也可以增加总花色苷质量分数，但长期的重度胁迫则不利于其积累。

2.3 水分胁迫对葡萄果实花色苷生物合成相关基因表达量的影响

在葡萄果实转色后，与花色苷生物合成相关基因的表达量均呈现逐渐上升后下降的趋势(图3)。不同程度水分胁迫处理对相关基因表达量的影响不同。T1、T2和T3处理PAL基因相对表达量从70 d至110 d均高于CK，表明水分胁迫处理导致PAL基因表达量的增加。T1和T2组 CHS1、DFR、 F3′H、 F3′5′H、UFGT和 MybA1基因相对表达量在70 d至110 d也基本上均高于CK，但T3组基本上在100 d至110 d低于CK，表明轻度和中度水分胁迫能使 CHS1、DFR、 F3′H、 F3′5′H、UFGT和 MybA1基因的表达量增加，而重度水分胁迫会降低果实成熟后期 CHS1、 F3′H、 F3′5′H和UFGT表达量而降低了总花色苷质量分数。

小写字母表示显著差异(P≤0.05)，未标注字母表示差异不显著，下同

Lowercase letters mean significant differences (P≤ 0.05), unmarked letters mean no significant differences.The same below

图2 水分胁迫下葡萄果实总花色苷质量分数
Fig.2 Total anthocyanin mass fraction of grape berries in water stress

2.4 葡萄果实总花色苷质量分数与花色苷生物合成相关基因相对表达量的相关性分析

在果实成熟过程中，花色苷合成与其相关基因的相对表达量具有一定的相关性(表4)，其中，PAL、 CHS1和 MybA1的相对表达量与总花色苷质量分数的相关系数较高。水分胁迫能提高一些基因与总花色苷质量分数的相关性。其中，T2处理下 CHS1的相对表达量与花色苷合成呈显著正相关，相关系数为0.897，T3组PAL和 MybA1的相对表达量与花色苷合成呈显著正相关，相关系数分别为0.900和0.904。

图3 水分胁迫下葡萄果实花色苷合成途径相关基因表达量Fig.3 Gene expression of anthocyanin biosynthesis pathway in grape berries in water stress

处理 TreatmentPAL CHS1DFRUFGT MybA1CK0.692-0.0420.3090.6430.818T10.7580.5530.4050.8120.648T20.853 0.897*0.8610.6350.811T3 0.900*-0.0380.355-0.297 0.904*

注：* 表示P≤0.05水平相关。

Note:* is related to the level ofP≤ 0.05.

3 讨论与结论

本研究表明，不同程度水分胁迫对葡萄果实组分影响不同，轻度和中度胁迫均降低果实百粒质量和TA质量浓度，提高TSS、总酚、单宁和总花色苷质量分数，而重度胁迫反之。在果实转色后，花色苷生物合成相关基因的表达量均呈先上升后下降的趋势。不同程度水分胁迫处理对相关基因表达量的影响也不同。轻度和中度胁迫上调了PAL、 CHS1、DFR、 F3′H、 F3′5′H、UFGT和 MybA1基因的表达量，重度胁迫降低了果实成熟后期 CHS1、 F3′H、 F3′5′H和UFGT表达量。相关性分析表明，中度胁迫 CHS1表达量与总花色苷质量分数呈显著正相关，重度胁迫PAL和 MybA1基因表达量与总花色苷质量分数呈显著正相关。

国内外大量研究表明，在不同物候期进行水分胁迫能改善葡萄果实的品质[20]。在葡萄转色期进行调亏灌溉会降低浆果的体积、质量以及酸度，且显著提高了可溶性固形物质量分数和果实酚类物质浓度[21]。本研究中，轻度和中度胁迫降低了浆果百粒质量、可滴定酸质量浓度，提高了可溶性固形物、单宁和总酚质量分数，与前人研究结果相一致。李云飞等[22]发现重度干旱会降低紫叶矮樱叶片可溶性糖和花青素质量浓度。本研究中重度胁迫降低了果实可溶性固形物、单宁和总酚质量分数，与其研究结果相似，这可能是由于重度胁迫抑制了植株的生长发育及代谢。Ollé等[23]发现无论在转色前还是在转色后对葡萄植株进行水分胁迫，都会增加果实花色苷的质量分数，但花色苷组分有所不同。本研究中，转色前轻度和中度胁迫处理均增加了总花色苷积累量，这与前人研究结果一致。但是，重度胁迫却降低了总花色苷质量分数，这可能是由于花色苷的积累与葡萄果实糖的积累有关[24]，而重度胁迫会降低葡萄果实糖的积累，导致花色苷质量分数降低。

周莉等[25]研究表明，从转色期开始，葡萄果实花色苷生物合成转录水平上调，在果实完熟后，转录水平下调。本研究中，葡萄果实转色至成熟，与花色苷生物合成相关基因的表达量均呈现先上升后下降的趋势，与其研究结果一致。水分胁迫会改变花色苷生物合成过程相关基因的转录水平，并上调葡萄花色苷合成途径 F3H、DFR、UFGT、 F3′H、 F3′5′H和GST基因的表达[26]。本研究中，轻度和中度胁迫使PAL、 CHS1、DFR、 F3′H、 F3′5′H、UFGT和 MybA1基因的表达上调，与前人研究结果一致。而重度胁迫降低了果实成熟后期 CHS1、 F3′H、 F3′5′H和UFGT表达量。因此，重度胁迫导致总花色苷质量分数降低，可能是由于UFGT是催化不稳定的花色素糖基化形成稳定的花色苷-3-葡萄糖苷的关键结构基因[27]，且重度胁迫显著降低了果实糖质量浓度。花色苷生物合成中相关基因表达量与总花色苷质量分数的变化具有相关性[28-29]。本试验表明，中度胁迫 CHS1表达量与总花色苷质量分数呈显著正相关，重度胁迫PAL和 MybA1基因表达量与总花色苷质量分数也呈显著正相关，这也验证了前人的结果，并且水分胁迫提高一些基因表达量与花色苷总量的相关性。

水分胁迫通过控制葡萄植株的生长发育改善葡萄浆果的成熟度，调节葡萄花色苷生物合成过程中相关基因的表达从而提高了葡萄果实总花色苷质量分数，同时也提高了水分利用效率[30-31]。本研究表明，轻度和中度胁迫有利于葡萄浆果品质的改善，促进了葡萄果实花色苷的生物合成，与对照相比分别节约灌水38.2%和69.1%，建议在生产中减少灌水，以达到合理的水分胁迫之目的，为生产优质葡萄酒提供优质原料。