一种快速高效提取花生叶片DNA的简化方法

刘 宇，李春娟，闫彩霞，赵小波，孔 青，孙全喜，苑翠玲，王 娟*，单世华*

(1. 中国海洋大学食品科学与工程学院，山东 青岛 266000； 2. 山东省花生研究所，山东 青岛 266100)

花生(ArachishypogaeaL.)隶属豆科(Leguminosaesp.)蝶形花亚科(Papilionoideae)花生属(Arachis)，是世界上最重要的油料作物之一[1]。同时，花生种子富含优质蛋白质，也是维生素和矿物质的良好来源[2]。大量研究者期望通过分子改良育种的方式获得高蛋白、高油酸和高抗性的花生品种。分子标记与辅助选择技术以基因组测序为重要参考(https://peanutbase.org/)，该技术可大大缩短育种周期，提高花生的育种效率[3]。而获得高质量的基因组DNA是相关研究开展的第一步，但是花生组织材料中的蛋白质、多糖、多酚物质以及其他次生代谢产物等给DNA的提取和纯化造成很大的阻碍。此外，下一代测序技术(Next Generation Sequencing, NGS)对DNA的质量有了更高的要求，传统的DNA提取方法SDS法与CTAB法提取花生叶片基因组DNA的浓度和纯度尚不能满足目前高通量测序的要求。另外，植物DNA提取试剂盒价格较高且普通存在提取总量较低的状况。因此，本研究旨在CTAB法基础上优化出一套成本低，耗时短的简化方法，并且能够适用于高通量测序的高质量DNA，为花生分子育种与筛选的研究奠定基础。

1 材料与方法

1.1 供试材料

本研究随机选用4个花生品种(表1)。每个品种选取2～4粒完整饱满种子，于培养皿中避光浸种3～4 d，待芽长至2～4 cm后置入培养盒，光照培养箱(温度：25 ℃；光照强度：12000 lx)培养10～13 d。实验时取第三对真叶。

表1 四份DNA提取花生品种信息

1.2 DNA提取

1.2.1 快速提取花生叶片DNA改良步骤如下：

(1) 称取50 mg花生幼嫩叶片，置于1.5 mL离心管中，将离心管中下部浸入液氮，取出离心管后用已烧制成球状且预冷的200 μL枪头(液氮中浸泡4～5 s)快速研磨。

(2) 加入650μL预热的CTAB，加入RNase A酶6.5μL，涡旋振荡30s，颠倒混匀后，迅速放入65℃水浴锅中孵育30min。每10min颠倒混匀一次。

(3) 从水浴锅中取出样品管，加入650 μL预冷的酚-氯仿(25∶24)，盖好管盖后缓慢上下颠倒摇动5～10 min。10000 r/min下离心10 min。重复本步骤一次。

(4) 用移液枪缓慢吸取上层清液650～700 μL至1.5 mL离心管中。

(5) 在获得的上清液中沿管壁缓慢加入预冷的异丙醇500 μL，可观察到接触面有沉淀层产生。

(6) 快速吸去上层与下层液体，将中间沉淀层转移至新的离心管当中。

(7) 加入600 μL 70%乙醇600 μL洗涤沉淀，振荡数秒钟，5000 r/min条件下离心1 min去上清液。重复本步骤一次。

(8) 室温下干燥DNA沉淀，当有无色胶状物附在管壁时，加入70 μL TE缓冲溶液(Tris-EDTA buffer solution)溶解沉淀的DNA。

1.2.2 CTAB法花生叶片DNA提取步骤

用常规CTAB法[4]提取DNA。

1.3 DNA检测方法

1.3.1 总DNA电泳检测

以DL 15000 DNA Marker(TaKaRa, Dalian)为标记， 取DNA溶液2 μL与适量6×Loading Buffer(TaKaRa, Dalian)混匀，点入含有Super GelRed(US EVERBRIGHT, Suzhou)的1% DNA琼脂糖(US EVERBRIGHT, Suzhou)凝胶中，1×TAE缓冲液电泳，于凝胶成像分析系统(Tanon 2500R, Shanghai)获取图像。

1.3.2 DNA浓度和纯度检测

取1 μL DNA提取液于Nanodrop-超微量分光光度计(Pultton P100/P100+，Shanghai)样品室中，检测其相对浓度以及根据OD260/OD280、OD260/OD230值确定DNA的纯度，每个样品检测三次，求平均值。

2 结果与分析

2.1 不同提取方法DNA提取时间比较

使用花生叶片DNA简化提取法完成四个花生叶片的 DNA 提取共用时约1h 15min，而使用CTAB 法完成相同规模DNA 提取则需要 3 h左右，时间缩短一半以上。

2.2 不同提取方法对DNA完整性的影响

从CTAB 法提取的花生叶片总 DNA的非变性琼脂糖凝胶电泳图(图1 A)可见，该法提取的花生叶片DNA的条带都有拖尾，带型不整齐，说明DNA已有部分降解，DNA完整性较差；此外，点样孔中有白亮物质，说明样品DNA中残留有少量的多糖、蛋白质或其他杂质[5]。

图1 花生叶片总DNA琼脂糖凝胶电泳结果Fig. 1 Agarose gel electrophoresis of DNA extracted from peanut leaves 注： A:CTAB法 CTAB method; B:提取简化法 Simplified method

表2 两种方法提取花生叶片的总DNA 质量比较

注： 表中浓度及纯度值均为三个重复样品的平均值。

Note: All DNA concentration and purity data is the average value from three repeats

从DNA简化法提取的花生叶片总DNA的琼脂糖凝胶电泳图 (图 1 B)可见，花生叶片DNA的条带清晰单一，带型整齐，点样孔中未发现有白亮物质，说明获得的DNA完整性好、未发生降解。由此可见，经过DNA简化方法提取的DNA完整性显著提高，且未发现残留的酚类物质、蛋白质或其他杂质，DNA提取效果显著增加。

2.3 不同提取方法对DNA纯度与产量的影响

OD260与OD280的比值通常用于DNA纯度的判定。OD260/OD280>2.0表示有RNA污染，OD260/OD280<1.6表示有蛋白质污染，OD260/OD280为1.6～2.0时，表明DNA纯度较高[6]。

表2可知，CTAB法提取DNA的OD260/OD280值范围为1.372～2.370，其中样品1与样品3的OD260/OD280值<1.6，表明样品DNA中的蛋白质未除尽；样品2与样品4的OD260/OD280值>2.0，表明样品出现RNA污染；OD260/OD230值为1.469～1.958，表明样品DNA中出现酚类物质污染；每0.1 g花生嫩叶可提取约13 μg DNA。DNA简化法提取DNA的OD260/OD280值一般为1.7～2.0，表明提取的样品DNA中蛋白质含量都较低；同时，OD260/OD230值一般为2.0～3.0，表明样品中基本没有酚类物质污染；每0.1 g花生嫩叶可提取约16 μg DNA。

简化法提取的DNA样品中RNA、蛋白质、酚类等物质含量较低，OD260/OD280、OD260/OD230值比较理想，DNA质量较高，且与CTAB法相比，单位质量花生叶片提取的DNA产量较高。DNA提取简化法DNA提取质量明显优于CTAB法。

3 讨 论

随着分子生物学的快速发展，以植物DNA为基础的分子克隆等分子生物技术、DNA标记分析以及基因组重测序的研究不断深入，获取高质量的DNA成为相关研究的重要前提。然而花生DNA中往往会蕴含丰富的RNA、蛋白质、多酚类物质和多糖等杂质，影响实验的进行[7-8]。因此，开发一种更快捷、更高效的DNA提取方法是必要的。周贤达[9]等为解决田间西瓜叶片提取 DNA 杂质较多及逐个样品提取效率低的问题，开发了一种基于96孔PCR板的西瓜叶片DNA快速提取方法，提取的 DNA浓度为287～573 ng·μL-1，并且DNA提取液中含有较少的蛋白质、酚类及小分子杂质。丁浩[10]等在CTAB裂解后直接添加RNase A，然后再经过一系列的抽提、沉淀、洗涤，获得高质量的DNA，减少了RNA的污染。陈林杨[11]等在裂解细胞之前，向磨碎的植物材料中加入干扰物清除液，去除植物材料中干扰DNA提取的代谢物，并在后续步骤中进行了一些优化，并且该法应用于CTAB法和Plant DNA Mini Kit试剂盒时DNA的质量均获得提升。此外，使用高盐TE缓冲液(1.0～2.5 mol/L NaCl)、DNA沉淀前乙醚和NaCl 以及细胞核裂解之前去除细胞质中的杂质等改良方法，可有效地减少多糖、多酚类杂质污染，提高DNA提取质量[12-14]。

本研究基于传统的CTAB法，对提取花生叶片DNA进行如下改进：① 以烧制成圆球状的枪头与离心管的一体研磨装置代替了传统的研钵研磨装置；② 在水浴裂解细胞之前加入RNase A；③ 加入异丙醇后，在DNA沉淀时将其迅速分离。与传统的CTAB法相比，其优越之处在于在保证高质量的前提下，操作简单易行，时间短，成本低。在样品预处理阶段，直接使用酒精灯烧制成球状的枪头在离心管中研磨叶片节省了从研钵向离心管中转移叶片组织的时间，减少了叶片组织的浪费，相同质量的叶片组织可获得较多的DNA产量，同时免去了灭菌、清洗研钵的繁琐工作。

此外，与使用自动化样品研磨仪器相比，降低了花生叶片DNA的提取成本；另外，在DNA沉淀阶段，在低温放置的异丙醇加入离心管时，接触面会产生絮状DNA沉淀，迅速将沉淀分离，可减少多糖、蛋白质、多酚类等物质的含量，从而提高DNA的质量与纯度，同时也减少了DNA沉淀时所用的时间。提取同样规模的组织样品，改进法可以节省约二分之一的时间，并且其提取DNA的质量、纯度以及产量均优于传统CTAB法。此外，该改进方法在PlantZol试剂盒(TRAN，北京)提取的DNA质量也得到相应提升。该方法可作为一种快速高效的花生叶片DNA提取的简易方法，适用于分子生物学实验和高通量测序等后续研究。