苜蓿草粉和黄酮对断奶仔猪结肠微生物区系的影响

曲根，刘建宇，郭志鹏，王苗利，管永卓，张靖雪，郭玉霞*，严学兵，张明，3

(1.河南农业大学牧医工程学院，河南 郑州450002;2.扬州大学动物科学与技术学院，江苏 扬州225000;3.濮阳职业技术学院，河南 濮阳457000)

被誉为“牧草之王”[1]的苜蓿(Medicago sativa)中含有的生物活性物质(苜蓿皂苷、苜蓿多糖和苜蓿黄酮)有以下作用，如抗氧化，抗菌，提高生长性能，提高免疫;而且苜蓿还可以作为人的保健品使用，如苜蓿饮料[2]。随着研究的深入，对苜蓿生物活性物质研究越来越多，尤为关注苜蓿黄酮。虽然黄酮的研究报道较多，但是苜蓿黄酮在动物上的研究比较少[3]。研究发现，苜蓿黄酮可以改变奶牛瘤胃细菌的群落结构和组成，进而影响营养物质的消化和代谢[4]。研究发现，通过体外培养法，厌氧条件下培养液中大豆异黄酮(异黄酮属于黄酮类化合物)浓度为100 mg·L-1，对山羊瘤胃代谢影响最显著[5]。研究表明，苜蓿黄酮可以稳定瘤胃绵羊发酵功能，且受添加量影响[6]。

近几十年来，养猪业由于抗生素的滥用，使猪肠道细菌产生了耐药性和药物残留。因此，寻找一种抗生素替代品无药物残留、无耐药性、无副作用的绿色添加剂成为近年来人们关注的热点，其中植物提取物是研究的热点之一。黄酮类化合物由于独特的γ-吡喃苯环结构，具有抗癌[7]，抗氧化[8-9]，抗菌[10]，促进脂类代谢[11]和类雌激素样[12]等药理作用，因其促进动物健康和提高生产性能而广受关注。苜蓿黄酮在未来，很有可能作为一种绿色饲料添加剂、保健剂用于仔猪饲料中，使养猪业减少抗生素等药物的应用，提高仔猪机体免疫力。

研究肠道微生态的方法很多，高通量测序技术可以全面的反应肠道微生态的丰度及多样性的优点而被广泛应用于研究猪肠道微生物[13]。目前，苜蓿草粉和苜蓿黄酮对断奶仔猪结肠微生物区系的影响研究未见报道。因此，本试验通过16S r DNA高通量测序的方法研究苜蓿草粉和苜蓿黄酮对断奶仔猪结肠微生物区系的影响。探讨苜蓿黄酮是如何改变结肠微生物区系来影响仔猪肠道营养及消化代谢的，为苜蓿黄酮在仔猪中的应用提供一些参考价值。

1 材料与方法

1.1 试验材料

苜蓿黄酮购买于陕西绿清生物工程有限公司，黄色粉末，其中总黄酮含量为50%。

苜蓿草粉的主要营养成分:粗蛋白15.24%、粗脂肪2.7%、粗纤维21.6%、粗灰分9.3%、钙1.4%、磷0.19%。

1.2 试验设计

选取体重和胎次相近的(35±1)日龄“杜×长×大”三元杂交断奶仔猪120头，随机分成5组，每组3个重复，每个重复8头猪，公母各占1/2。对照组饲喂不添加苜蓿草粉和苜蓿黄酮的基础饲粮，试验组分别添加1(Ⅰ组)、2(Ⅱ组)、4(Ⅲ组)g·kg-1苜蓿黄酮和50 g·kg-1苜蓿草粉(Ⅳ组)。试验在许昌市许昌县苏桥镇许昌缘自然农业发展有限公司进行。试验期间所有仔猪都是自由采食、自由饮水，并且按照猪场的常规管理程序驱虫、消毒、免疫防疫，预试验期3 d，正式试验期32 d。试验期间的基础饲料由郑州市大北农饲料科技有限公司提供。饲料原料包括:玉米、发酵豆粕、膨化豆粕、大豆浓缩蛋白、乳清粉、鱼粉、豆油、氯化锌、石粉、氨基酸、氨基酸盐及其类似物、矿物质元素及其螯合物、乳猪0.5%复合预混合饲料(大北农集团)。

1.3 样品采集

试验样品采集时间为2017年11月。在试验最后一天，对每组每个重复随机选取一头猪颈部放血致死，解剖腹部，找到肠道的结肠部位并用酒精浸泡过的绳子结扎两端，然后用生理盐水冲洗结肠表面，用纱布蘸干水分，用手术刀剪开肠道，将内容物挤到5 m L冻存管里面，立刻放入液氮罐，带回实验室-80℃保存。

1.4 结肠微生物DNA提取及PCR扩增

将样品在干冰保存下送至上海美吉生物医药有限公司，根据FastDNA SPIN Kit for Soil试剂盒说明书步骤进行总DNA的抽提，DNA浓度和纯度利用NanoDrop 2000进行检测，利用1%琼脂糖凝胶电泳检测DNA提取质量;用338F(5′-ACTCCTACGGGAGGCAGCAG-3′)和806R(5′-GGACTACHVGGGTWTCTAAT-3′)引物对V3-V4可变区进行PCR扩增，扩增程序为:95℃预变性3 min，27个循环(95℃变性30 s，55℃退火30 s，72℃ 延伸30 s)，最后72℃延伸10 min(PCR仪:ABI Gene Amp®9700型)。扩增体系为20μL，4μL 5×Fast-Pfu缓冲液，2μL 2.5 mmol·L-1dNTPs，0.8μL引物(5μmol·L-1)，0.4μL FastPfu聚合酶;10 ng DNA模板。

1.5 Illumina Miseq测序

使用2%琼脂糖凝胶回收PCR产物，利用AxyPrep DNA Gel Extraction Kit(Axygen Biosciences，Union City，CA，USA)进行纯化，Tris-HCl洗脱，2%琼脂糖电泳检测。利用QuantiFluorTM-ST(Promega，USA)进行检测定量。构建文库步骤:1)通过PCR将Illumina官方接头序列添加至目标区域外端;2)使用凝胶回收试剂盒切胶回收PCR产物;3)Tris-HCl缓冲液洗脱，2%琼脂糖电泳检测;4)氢氧化钠变性，产生单链DNA片段。

测序的原理是边合成边测序，同时DNA扩增表面读取DNA片段。首先把各个样本放在流通槽里同时在Illumina测序平台进行分析;DNA双链与引物进行连接至片段DNA两端;变性退火变成的DNA单链和引物随机的将一端固定在流通槽内表面上;添加未被标记的碱基以及相应的酶进行固相桥型配对，然后进行桥型扩增;变性退火变成单链DNA;PCR扩增，在流通槽各个通路中产生密集的双链DNA簇;将双链DAN变性退火变成单链;加入标记过的d NTP、引物、DNA聚合酶，进行第一个测序循环;在激光照射后，捕捉第一轮反应的碱基;去掉阻断基团和荧光基团，进行第二个测序循环;统计荧光标记碱基，将数据分析对比得到DNA片段序列(图1)。

1.6 数据统计分析

MiSeq测序得到的是双端序列数据，首先根据PE reads之间的overlap关系，将成对的reads拼接(merge)成一条序列，同时对reads的质量和merge的效果进行质控过滤，根据序列首尾两端的barcode和引物序列区分样品得到有效序列，并校正序列方向，即为优化数据。通过i-Sanger云分析平台对优化数据进行生物信息学分析，根据序列相似度为97%的原则，将序列分为多个操作分类单元(operational taxonomic unit，OTU)。通过(http://www.i-sanger.com/)云平台进行细菌群落丰富度和多样性分析、物种组成分析、样本比较分析和物种差异分析。

采用Excel进行数据整理，采用(http://www.i-sanger.com/)云平台物种差异分析中的单因素方差分析进行差异显著性检验，数据均以均值±标准差表示(细菌门只以均值表示)，以P＜0.05为差异显著性判断标准。

图1 PCR扩增电泳Fig.1 PCR amplification electrophoretogram

2 结果与分析

2.1 苜蓿草粉和苜蓿黄酮对结肠细菌丰富度和多样性的影响

试验经i-Sanger云平台优化后，共得到595701条优化序列，优化碱基数目为260613951，平均序列长度为437 nt。与对照组相比，试验Ⅰ组、Ⅱ组和Ⅲ组的优化序列呈先升高后降低再升高趋势，其中Ⅲ组显著提高(P＜0.05);与对照组相比，Ⅳ组优化序列显著降低(P＜0.05)。从图2可知，各个样品的稀释曲线趋于平缓，随着测序深度的增加，OTU水平的Sobs指数将不再增加，说明测序数量比较合理。基于97%相似性的原则进行OTU分析(图3)，5个组共产生484个OTUs，各组分别产生OTU数量为418(对照组)、463(Ⅰ组)、379(Ⅱ组)、446(Ⅲ组)、406(Ⅳ组)，其中共享327个OTUs，占总OTU数量的67.56%。从表1中可知，Sobs指数中各组之间OTU实际观测值无显著差异(P＞0.05);与对照组相比，Ⅰ组、Ⅱ组、Ⅲ组和Ⅳ组ACE指数都有上升，其中Ⅰ组显著高于对照组(P＜0.05);Chao指数Ⅰ组显著高于对照组(P＜0.05)。各组中的Shannon指数和Simpson指数都无显著差异(P＞0.05)。说明苜蓿黄酮可以影响结肠细菌丰富度，其中试验Ⅰ组效果最为明显。

2.2 苜蓿草粉和苜蓿黄酮对结肠细菌组成和结构的影响

图2 每个样品的稀释曲线Fig.2 Rare faction curves of all samples

图3 OTU维恩图Fig.3 OTU venn

表1 苜蓿黄酮和苜蓿草粉对结肠细菌丰富度和多样性的影响Table 1 Effect of alfalfa flavonoids and alfalfa meal on the richness and diversity of bacteria in the colon

表2 苜蓿黄酮和苜蓿草粉对结肠细菌组成和结构的影响(门水平)Table 2 Effect of alfalfa flavonoids and alfalfa meal on composition and structure of bacteria in the colon(at the phyla level)

表3 苜蓿黄酮和苜蓿草粉对结肠细菌组成和结构的影响(属水平)Table 3 Effect of alfalfa flavonoids and alfalfa meal on composition and structure of bacteria in the colon(at the genus level)

图4 每个样品结肠细菌菌群分析(门水平)Fig.4 Bacteria in the colon microflora analysis(at the phyla level)

图5 每个样品结肠细菌菌群分析(属水平)Fig.5 Bacteria in the colon microflora analysis(at the genus level)

图6 多组间的差异分析Fig.6 Variance analysis in groups

在门水平上(表2)，与对照组相比，试验Ⅰ组、Ⅱ组和Ⅲ组的厚壁菌门相对丰度呈曲线升高而拟杆菌门相对丰度呈曲线下降。苜蓿草粉和苜蓿黄酮对其他菌门相对丰度均无显著影响(P＞0.05)。在属水平上(表3)，UCG-014、Erysipelotrichaceae和胃球菌属相对丰富度各组间差异显著(P＜0.05)，Anaerotruncus相对丰度各组间差异极显著(P＜0.01)。与对照组相比，Ⅰ组、Ⅲ组和Ⅳ组的梭菌属相对丰度显著提高(P＜0.05)。与对照组相比，试验Ⅰ组、Ⅱ组和Ⅲ组的乳酸菌属相对丰度呈先下降再上升再下降趋势。与对照组相比，试验Ⅰ组、Ⅱ组和Ⅲ组的链球菌属相对丰度呈线性升高，Ⅱ组升高效果较好(P＞0.05);粪球菌属相对丰度呈线性升高，Ⅱ组显著提高(P＜0.05)。与对照组相比，试验Ⅰ组、Ⅱ组和Ⅲ组的N K 3B 31、S24-7、Alloprevotella、Blautia、拟杆菌属、氏菌属相对丰度呈曲线下降(P＞0.05);真细菌属和Anaerotruncus的相对丰度中Ⅱ组显著提高(P＜0.05);NC2004相对丰度中Ⅲ组显著提高(P＜0.05)。以上结果说明，苜蓿草粉和苜蓿黄酮对结肠细菌群落组成和结构具有一定影响作用(图4～6)。

3 讨论

动物肠道内微生物的数量庞大，种类多，是构成动物必要的稳定的微生态系统，对病原菌的入侵有屏障作用，对营养物质的吸收有促进作用[14]。断奶仔猪微生态系统容易受生理、环境、营养等应激的影响而发生变化，导致疾病发生[15]。高通量测序技术可以快速高效地了解微生物群落结构和种类，更全面地了解苜蓿草粉和苜蓿黄酮对断奶仔猪结肠微生物区系的影响。

Sobs指数是用来估算OTU实际观测值，观测值升高后趋于水平说明测序数量比较合理。Chao指数是用来估计样本中OTU数目的指数，Chao指数越大，说明物种丰富度越大。ACE指数也是用来估计OTU数目的指数。Shannon和Simpson指数是用来估算微生物多样性的。Shannon指数越大，说明微生物多样性越高;Simpson指数越大，说明微生物多样性越低。试验中，各组之间的Shannon和Simpson指数趋于平衡，说明苜蓿草粉和苜蓿黄酮对断奶仔猪结肠微生物多样性无显著影响。试验结果表明，各试验组中仔猪结肠内厚壁菌门和拟杆菌门是优势菌门，这两菌门占总菌门的95%以上。研究表明[16]，厚壁菌门和拟杆菌门是仔猪粪便中含量最高的菌门，本试验结果与此相符。陈强等[17]研究表明，断奶仔猪肠道中厚壁菌门和拟杆菌门可对肠道中代谢碳水化合物发酵发挥作用。研究发现，肠道中某些拟杆菌门细菌基因组中有编码碳水化合物活性酶的基因，这些编码的酶类可以降解多糖[18]。所以，厚壁菌门和拟杆菌门在断奶仔猪结肠肠道中起着至关重要的作用。

在属水平中，乳酸菌属属于优势菌属，是一种有益菌属，是能治疗奶牛生殖道疾病的抗生素替代物之一[19]。从试验数据来看，添加苜蓿草粉和添加苜蓿黄酮对仔猪结肠微生物中的乳酸菌属有增加的可能。随着苜蓿黄酮添加量的增加，梭菌属的相对丰度都有增加，但Ⅱ组相对丰度增加不显著，说明Ⅱ组可能有抑制梭菌属的作用。凌代文[20]研究发现梭菌属可以发酵多种碳水化合物。研究发现，结肠碳水化合物被发酵产生大量的短链脂肪酸(short chain fatty acid，SCFA)，如乙酸、丙酸和丁酸等，而蛋白质降解和氨基酸发酵产物也是SCFA，梭菌属经丙烯酸发酵丙氨酸产生丁酸，同时也可以在苏氨酸脱氢酶作用发酵苏氨酸产生丙酸[21]，说明梭菌属参与结肠发酵活动。从试验中可知，苜蓿草粉和黄酮可以显著提高梭菌属相对丰度，影响结肠细菌发酵碳水化合物，进而影响碳水化合物消化代谢。苜蓿黄酮梯度组和苜蓿草粉组中Blautia相对丰度与对照组相比有降低，说明苜蓿草粉和苜蓿黄酮对Blautia有可能起到抑制作用。本试验与占今舜等[4]研究表明苜蓿黄酮对Blautia很可能产生抑制作用结果相一致。NK 3B 31和Prevotella 9都属于普氏菌属，这两菌属的相对丰度中，苜蓿黄酮梯度组相比于对照组都有降低的可能。孔祥杰等[22]研究表明，普氏菌属有降解半纤维素的作用。占今舜等[4]研究表明，苜蓿黄酮可能有提高普氏菌属数量的作用。从本试验结果来看，苜蓿草粉和苜蓿黄酮都很有可能提高胃球菌属的相对丰度，试验Ⅲ组对胃球菌属很有可能起到抑制作用。孔祥杰等[22]研究发现，胃球菌属可以利用日粮纤维物质提供的能量来维持自身生长繁殖需要。王鹏[23]研究发现，胃球菌属和普氏菌属都具有分解纤维类物质的能力。综上所述，苜蓿草粉和黄酮能够改变结肠微生物细菌组成和结构，进而影响营养物质的消化代谢。

4 结论

饲粮中添加苜蓿黄酮可以显著影响断奶仔猪结肠细菌丰富度且0.1%苜蓿黄酮组影响较大，添加50 g·kg-1苜蓿草粉对断奶仔猪结肠细菌丰富度影响作用不明显。添加苜蓿草粉和添加苜蓿黄酮对断奶仔猪结肠细菌的多样性无显著影响。

在门水平上，随着苜蓿黄酮添加量的增加，优势菌门中，厚壁菌门相对丰度有提高的可能而拟杆菌门有降低的趋势;添加5%苜蓿草粉组，厚壁菌门和拟杆菌门的相对丰度均无显著差异。在属水平上，添加一定量的苜蓿黄酮可以显著提高梭菌属、粪球菌属、真细菌属、NC2004属、Anaerotruncus属细菌的相对丰度而有降低N K 3B 31属、Alloprevotella属、Blautia属、拟杆菌属的相对丰度的可能;添加50 g·kg-1苜蓿草粉可以显著提高Anaerotruncus属、梭菌属的相对丰度而有降低Blautia属、氏菌属相对丰度的可能。