金纳米笼负载药物的制备及性能表征

2019-07-17单玉萍冷德基

长春工业大学学报 2019年3期

单玉萍, 冷德基，王涛，杨钰

(1.长春工业大学化学与生命科学学院，吉林长春 130012;2.长春工业大学材料科学高等研究院，吉林长春 130012)

0 引言

目前，癌症仍是危害人类健康的重大疾病。《2018全球癌症统计数据》报告显示，2018年全球将有近1 810万癌症新发病例和960万癌症死亡病例，75岁之前，癌症发病率累积风险为21.4%，癌症死亡风险为17.7%[1]。随着医学的发展，癌症的治疗方式逐渐增多，手术治疗、放射治疗和化学药物治疗这三种治疗方式仍是癌症治疗的主流手段。使用广谱抗癌药多柔比星(Doxorubicin， DOX)抑制DNA和RNA的合成来杀死肿瘤细胞属于化学药物治疗，但化学药物的非选择性使得DOX在治疗过程中也会对正常的组织和细胞造成杀伤，从而呈现出十分明显的毒副作用，且长期使用DOX会使肿瘤细胞产生耐药性[2-3]。因此,如何确保在靶向递送肿瘤药物的同时保护周围正常组织免受伤害,以及如何减轻癌症治疗的副作用等问题一直是癌症治疗方面的挑战性课题。纳米给药系统的出现使上述问题有了被解决的可能性，因此,通过包封和吸附等方法将DOX载入纳米药物载体制备成纳米药物的研究在药物研究中是很有潜力的新方向。

金纳米笼(AuNCs)作为金纳米粒子的一种形式，由于其独特的空心、多孔壁结构、良好的尺寸可调性[4]、优异的光热转换效应[5],以及良好的生物相容性[6]，被广泛应用于生物医学，尤其是药物输送和癌症治疗[7]。Zhang Z等[8]发现在近红外(NIR)照射下，AuNCs可以升高温度并有效地杀死癌细胞，因此AuNCs常用于肿瘤光热疗法(PTT)。Chuang E Y等[9]利用AuNCs包封药物并在NIR照射释放，进而实现PTT和药物疗法的协同治疗。在治疗过程中，细胞内吞是药物载体进入细胞的关键一步。研究发现HeLa细胞(宫颈癌细胞)对纳米药物载体的摄入不仅与药物载体的表面电荷有关，还受到药物载体粒径的影响。粒径大小对药物载体的载药量也有一定影响，小粒径的金纳米颗粒(GNP)比表面积大，在一定程度上可提高金纳米结合物的载药量[10]。粒径大小对载药量的影响十分重要，但目前研究不同粒径AuNCs载药量的报道比较少。

文中将采用不同尺寸的AuNCs作为载体，通过物理包封法，就尺寸大小对AuNCs包封DOX载药量的影响进行研究，为AuNCs作为纳米药物载体制备纳米药物提供理论依据。

1 实验部分

1.1 试剂与仪器

实验所用50、100 nm AuNCs购买于上海羧菲生物医药科技有限公司，DOX购买于阿拉丁。实验所用仪器分别为密理博超纯水机、Eppendorf Centrifuge 5804R型离心机、WGL-458型电热鼓风干燥箱、JSM-7610F型紫外-可见-近红外分光光度计、KQ-300E 超声波清洗器、移液枪、分析天平、pH计、SW-CJ_IFD洁净工作台。

1.2 AuNCs物理包裹DOX

在室温下，DOX与AuNCs的分散体系混合，即可得到AuNCs作为药物载体的纳米药物(DOX@AuNCs)。具体实验过程如下：取50 μL 1 mg/mL DOX溶液于5 mL的棕色离心管中，取1 mL 50 nm AuNCs溶液逐滴加入离心管中，边加边摇晃，然后将其置于摇床中，遮光震荡24 h,使其混合均匀；将混合均匀的溶液在16 800 g的条件下离心20 min，分离上清液，剩余沉淀在8 500 g的条件下用适量的4 ℃超纯水低温离心7 min，然后分离上清液，重复三次至上清液无明显颜色。分离的上清液遮光留存以备后续实验的进行，而通过纯化后的沉淀即为纳米药物(DOX@50 nm AuNCs)，将其重悬在4 ℃超纯水遮光保存。取1 mL 100 nm AuNCs溶液重复上述实验步骤可得纳米药物(DOX@100 nm AuNCs)以及100 nm AuNCs负载药物DOX过程中分离的上清液。

1.3 AuNCs载药量的计算

先绘制吸光度(Absorbance, Abs)与DOX浓度的标准曲线，再通过测量上清液中DOX的Abs来计算未载入AuNCs的DOX量，最后按照如下公式计算AuNCs的载药量:

AuNCs载药量=DOX总量-DOX上清液的量。

(1)

1.3.1 DOX标准溶液的制备

取1 mL,1 340 μg/mL的DOX标准溶液于离心管中，加入1 mL超纯水，配置成670 μg/mL的DOX标准溶液。再取0.2 mL,1 340 μg/mL的DOX标准溶液加入另一离心管，再加入1.8 mL的超纯水，配置成134 μg/mL的DOX标准溶液。以此类推，分别配置67、13.4、6.7 μg/mL的DOX标准溶液。配置的DOX标准溶液均需保存在棕色离心管中。

1.3.2 标准曲线的绘制

在相同测试条件下，用紫外可见分光光度计对各个浓度的DOX标准溶液进行测量，以超纯水作为空白溶液进行参比。发现DOX在λ=480 nm处有紫外吸收特征峰，取各个浓度的DOX标准溶液在该波长的Abs，绘制Abs与DOX浓度的标准曲线，即Abs-DOX浓度曲线。

用紫外可见分光光度计测量所得的上清液在480 nm处的Abs，然后参照Abs-DOX浓度曲线计算出上清液中DOX的量，再按照式(1)计算出AuNCs的载药量。

2 结果与讨论

DOX能够吸附在AuNCs的表面，从而导致DOX的荧光淬灭；而游离的DOX与AuNCs之间的作用则很弱，AuNCs不能有效淬灭DOX的荧光[11]。使用荧光光谱法在激发波长为480 nm的条件下对DOX@50 nm AuNCs溶液及等效DOX浓度的游离DOX溶液进行表征。经归一化后DOX@AuNCs溶液的峰型和等效DOX浓度的游离DOX溶液的峰型基本一致，在558 nm和585 nm处均有DOX的特征峰。我们发现归一化前，DOX@AuNCs的荧光光谱与游离DOX溶液相比强度略微降低，这是由于一部分DOX吸附在AuNCs表面，从而导致DOX的荧光淬灭。荧光谱图证实了AuNCs成功负载了药物DOX，如图1所示。

(a) DOX和DOX@50 nm AuNCs (b) DOX和DOX@100 nm AuNCs

图1 荧光图谱

AuNCs表面结合有柠檬酸而带有负电荷，在pH为7.4时，DOX分子因为含有氨基官能团，氨基因为质子化会带正电，静电作用使DOX与AuNCs结合。当DOX与AuNCs结合后，AuNCs会影响DOX的光谱性质，不便于检测DOX载药量的多少[12]。所以,文中又利用紫外可见吸收光谱法对DOX@AuNCs及其上清液进行表征，如图2所示。

(a) DOX和DOX@50 nm AuNCs (b) DOX和DOX@100 nm AuNCs

图2 UV-vis图谱

DOX@50 nm AuNCs和DOX@100 nm AuNCs的UV-vis图谱在λ=480 nm附近均出现DOX的特征吸收峰，验证了AuNCs成功负载药物DOX[13]。再确认上清液中DOX的量，然后按照式(1)计算出AuNCs的载药量，最后计算得不同尺寸的DOX@AuNCs摩尔浓度。

利用紫外可见分光光度计对50 nm AuNCs负载药物DOX后分离的上清液进行表征，得到50 nm AuNCs负载药物DOX后分离的上清液的UV-vis图谱。可得DOX@50 nm AuNCs的上清液中剩余的DOX的吸光度如图3所示。

图3 DOX@50 nm AuNCs的上清液的UV-vis图谱

再与DOX的标准曲线相对照，可得上清液中剩余DOX的浓度，如图4所示。

图4 Abs-DOX浓度曲线

最后用载药量的计算式求得本次实验中1 mL 1.88×10-3nM 50 nm AuNCs[14]的载药量为14.24 μg。同理可得本次实验中1 mL 1.88×10-3nmol 100 nm AuNCs的载药量为193.72 μg。经归一化后发现等摩尔浓度100 nm AuNCs的载药量是50 nm AuNCs载药量的10倍以上，见表1。