支原体感染与类风湿关节炎发病相关性研究

李晓莹 宋亚丽 陈腊梅 王盛华 路 麒

类风湿关节炎是一种常见的系统性炎性自身免疫性疾病，具有较高的发病率、致残率，其发病机制表现十分复杂，临床医学研究尚未完全明确，涉及抗原、趋化因子、一系列的免疫反应、巨噬细胞及细胞因子等多种因素，最终造成软骨、骨出现降解，进而导致关节畸形、关节强直[1，2]。目前认为未引起脓毒血症的慢性感染与类风湿关节炎存在一定关联性，其能作为诱因、病因造成类风湿关节炎发病，或进一步加重病情，增加复发风险[3]。支原体感染在类风湿关节炎发病中的作用逐渐受到关注，动物模型与患者关节液内分离出支原体。但支原体的体外培养时间长、难度大，加之易受采样及运送、保存、用药等相关因素影响了研究结果[4]。基于此，本研究通过收集患者体液进行PCR检查，探讨支原体感染与类风湿关节炎发病的相关性。

1 资料与方法

1.1 入选标准 确诊为类风湿关节炎，患者及其家属对本研究均知情，并签署知情同意书。排除标准:①合并有严重的高血脂、高血压、血栓性疾病、糖尿病、心脑血管疾病、血小板疾病及肝肾功能异常等疾病；②重叠其他类型风湿病[5]；③并发恶性肿瘤；④合并沙眼衣原体感染或其他严重感染者。

1.2 一般资料 选取2017年1～12月期间在我院接受诊治的120例类风湿关节炎患者作为研究对象，均符合入选标准。其中男57例，女63例，年龄40～52岁，平均(45.6±8.5)岁；病程1～12年，平均(5.2±2.3)年。

1.3 方法

1.3.1 采集标本 所有患者入院接受诊治时均采集咽拭子，并采集部分患者的尿道拭子(57例)、关节液(43例)、宫颈拭子(20例)标本。(1)男性患者：从前尿道1～2 cm位置用无菌拭子取男性患者的尿道分泌物。(2)女性患者：采集患者宫颈分泌物，采集标本时需先将宫颈口的多余黏液擦去，并于宫颈管内1～2 cm位置用另一拭子取宫颈分泌物，采集过程中需在宫颈中旋转，停留>20 s，便于获取更多细胞。

采集标本过程中需特别注意支原体对相关细胞表面存在很强的亲和力，需尽量多采集细胞，采集标本后需快速接种，避免在室温、普通冰箱内长时间保存，预防拭子干燥而导致支原体活力下降或死亡。

1.3.2 标本处理 将采集的所有拭子标本立即放入内含无菌生理盐水1～2 mL的洁净试管内进行振荡、洗涤，并用移液器收取混悬液400 L后放入0.5 mL的离心管内。而血液标本，在吸取0.5 mL血清后放入0.5 mL的离心管内，后经15000 r/min离心5 min，将上清液吸弃，并加入裂解液(由0.5%的非离子去污剂配制成的400 g/L蛋白酶K溶液)，后开展55℃水浴1 h，再开展95℃水浴5 min。最后经10000 r/min离心30 s，留取上清液，即为nPCR模板液[6]。

1.3.3 支原体检测 所有标本均用PCR方法检测解脲脲原体(Uu)、关节炎支原体(Mar)、人型支原体(Mh)及发酵支原体(Mf)等，所有操作均参照说明书执行。结合套式PCR产物应用全自动荧光法分析DNA序列。

1.3.4 骨密度检测 采用骨密度检测仪对患者腰椎L2-4、左股骨颈骨密度进行检测。

1.3.5 影像学检查 采用X线等影像学方法对患者双手及腕关节进行检查，判断关节破坏改变，根据关节破坏程度分成4期，I期：关节周围的软组织出现肿胀阴影，且关节端产生骨质疏松；II期：关节间隙由于软骨破坏而不断狭窄；III期：关节面产生虫凿样的破坏性改变；IV期：关节出现半脱位情况，且关节破坏后发生纤维性、骨性强直[7]。

1.4 类风湿关节炎病情评估 依据28个关节平均疾病活动性指数(DAS28)相关评分标准对类风湿关节炎的病情活动性进行评估，包括触痛关节数、肿胀关节数等内容，总分0～10分，评分越高代表病情活动性越高[8]。

2 结果

2.1 支原体检测情况 120例类风湿关节炎患者Uu、Mar、Mh及Mf检测结果显示，部分患者咽拭子、尿道拭子、关节液检出支原体。见表1。

表1 120例类风湿关节炎患者支原体检测阳性情况 n(%)

2.2 Uu阳性与阴性患者检测结果 类风湿关节炎患者中Uu阳性、阴性者骨密度减少或骨质疏松、DAS3.2～5.1、DAS>5.1、影像学差异有统计学意义(P<0.05)。见表2。

表2 120例类风湿关节炎患者中Uu阳性、阴性相关检测结果比较 n(%)

3 讨论

类风湿关节炎是常见的慢性、进行性炎症疾病，其发病与细菌诱发因素的相关性是临床关注重点之一，包括穿透支原体、逆转录病毒及发酵支原体等相关微生物[9,10]。支原体是指缺乏细胞壁的最小原核型微生物，结构简单，多数呈球形，没有细胞壁[11]。解脲脲原体作为常见的支原体，属于支原科目，是支原体科及脲原体属之一[12]。依据分析生物学特征能分成2大生物群、14个血清型，其中生物1群主要包括1、36、14等较小的基因组，在支原体感染内约占90.0%～92.0%[13]；而生物2群主要包括余下10个较大血清型基因组，在支原体感染内约占8.0%～10.0%，由患者尿道分离获取的主要表现为4型基因组[14]。目前，临床医学多认为支原体致病性主要来源于细胞膜表面存在的脂质相关膜蛋白(LAMPs)，脂蛋白是其主要成分，存在良好的抗原性，能对宿主细胞的免疫应答进行激发，且能与宿主细胞产生相互作用，研究发现支原体感染和类风湿关节炎发病存在相关性[15]。

本研究结果显示，类风湿关节炎患者的咽拭子、尿道拭子、关节液均检出不同比例的支原体，其中Uu、Mh的检出率高于Mar、Mf。说明支原体感染与类风湿关节炎发病存在一定相关性，分析支原体感染在类风湿关节炎发病过程中可能起到辅助作用[16]。近年来，随着临床检测、诊断医学法发展，支原体生物学特征的深入研究显示，不同支原体存在相同生物学特征，均可牢固的黏附于宿主细胞，能进入细胞而产生细胞毒性作用[18]；且均能导致单核/巨核细胞、NK细胞及肺成纤维细胞的相关非特异性免疫释放过量白细胞介素、肿瘤坏死因子-α、干扰素等相关细胞因子、一氧化氮。研究显示，支原体等相关微生物能经直接感染及间接交叉免疫反应、超抗原、蛋白抗原等相关途径产生自身免疫反应。本研究结果表明，类风湿关节炎患者中Uu阳性、阴性者在骨密度减少或骨质疏松、DAS3.2-5.1、DAS>5.1、影像学II期方面存在一定差异；说明Uu感染和类风湿关节炎的病情活动存在相关性，同时Uu感染可能对成骨细胞、破骨细胞的相关动态平衡造成破坏，对骨质沉积造成不良影响。类风湿关节炎极大地影响患者的生活质量，故对疾病活动性及发展进行评估是目前临床医生关注的热点[4]。DAS28是临床评估类风湿关节炎病情活动的综合评估标准，其依据患者实验室指标、关节肿痛数，对疾病活动性进行客观评价。本研究对入住患者的DAS28评分分析也进一步提示支原体感染与类风湿关节炎病情活动的相关性。Uu等多种支原体和人类具有共同抗原，且支原体能对人体免疫机能、细胞功能进行干扰。而滑膜组织内高水平核因子kB受体活化因子配体能对破骨细胞凋亡进行抑制，增强受累关节破骨细胞分化，增加活性，将破骨细胞激活使骨组织脱钙，并释放一定组织蛋白酶使骨基质蛋白降解，导致受累关节破坏进一步加重。但无法明确支原体感染在类风湿关节炎发病机制中起到的作用是属于激发者或是伴随者，后面需增加样本量进行深入性研究。

综上所述，解脲脲原体等相关支原体感染在类风湿关节炎发病早期中起到重要作用，与患者关节骨质破坏及关节功能障碍、生活质量降低存在一定相关性，检测支原体水平能从一定程度上评估类风湿关节炎病情进展。