TRPV1在大鼠气管内注入胃液导致肺纤维化过程中的作用

付悦 孔灵菲

中国医科大学附属第一医院呼吸与危重症医学科，沈阳110001

特发性肺纤维化(Idiopathic pulmonary fibrosis，IPF)是一种慢性、进行性、不可逆的间质性肺疾病。美国每年约有40 000例发病，诊断后的中位生存期仅为3～5年[1-2]，尚缺乏疗效显著的治疗药物。很多研究发现胃食管反流病(gastroesophageal reflux disease，GERD)和胃内容物误吸在IPF患者中很常见，西方IPF患者GERD发病率高达67%～88%，在中国为62.3%。目前，IPF病因尚不明确，但胃食管反流已经被公认为IPF的危险因素之一。Lee等[3]发现，IPF患者肺泡灌洗液的p H值下降且胃蛋白酶浓度有所升高。此外，许多动物实验已经证实，慢性持续胃酸吸入会导致肺纤维化和其他呼吸系统疾病[4-6]。

瞬时感受器电位香草酸受体1(transient receptor potential vanilloid 1，TRPV1)最初被认为是表达在初级神经元上的辣椒素和相关天然刺激物的受体，后来发现是一种表达在多种类型细胞上的非选择性阳离子通道，可被热、辣椒素、内源性H+以及反流胃液中的盐酸激活[7-8]。TRPV1主要通过信息整合，经由Ca2+通道对细胞的功能产生影响，与心肌、肝、肾等多种组织纤维化密切相关[9-10]。本研究采用气管内注入胃液的方式复制胃食管反流引起胃液误吸的模型，采用TRPV1抑制剂辣椒平 (capsazepine，CPZ)进行干预，观察TRPV1对大鼠胃液微吸入导致肺纤维化的作用。

1 材料与方法

1.1 实验动物 SPF级雄性SD大鼠30只，6～7周龄，体质量 (200±20)g，由辽宁长生生物有限公司提供，将大鼠饲养于温度为20～25℃，湿度40%～70%，人工12 h昼夜循环的环境中，自由进食水。

1.2 主要试剂 羟脯氨酸测定试剂盒 (南京建成公司)，Masson染色试剂盒 (南京建成公司)，大鼠转化生长因子β1(transforming growth factor-β1，TGF-β1)酶联免疫吸附试验试剂盒 (美国R&D公司)，CPZ(美国 MCE公司)，TRPV1一抗(美国 Abcam 公司)，α-平滑肌肌动蛋白(α-smooth muscle action，α-SMA)一 抗 (美国Abcam公司)，Ⅰ型胶原蛋白一抗 (美国Abcam公司)，免疫组织化学二抗试剂盒 (福州迈新生物技术开发公司)，DAB显色试剂盒，ECL发光液(美国Bio-rad公司)。

1.3 动物分组 将30只SD大鼠随机分为3组：对照组、模型组和CPZ干预组，每组10只。模型组经气管插管注入大鼠胃液0.5 ml/kg，对照组注入等量生理盐水，CPZ干预组在气管插管前30 min腹腔注射CPZ 10 mg/kg。所有操作每周1次，连续8周。

1.4 造模方法 将健康雄性SD大鼠适应性饲养1周后，采用气管插管注入大鼠胃液的方式模拟胃食管反流大鼠误吸胃内容物的模型。将大鼠用10%水合氯醛以3.5 ml/kg的剂量腹腔注射麻醉后，针刺大鼠脚掌无反射，证明麻醉充分。将大鼠仰卧位置于手术板上，头朝向术者，固定头部和四肢，手术板头侧抬高30～45°，用纱布包裹鼠舌，将鼠舌向左外上方拉出口腔，使其暴露声门。调整额镜将照射光源对准声门，即可看见声门随呼吸开闭，趁声门开启时顺势将静脉留置针插入气管，见管口棉球随呼吸摆动，证明插管成功。将胃液注入气管，随即注入少量空气，保证液体全部注入气管，完毕后立即将动物直立、左右摇晃，以确保液体在肺内均匀分布，待其清醒后，放回鼠笼。

1.5 标本采集 首次气管灌注9周后，称重，以10%水合氯醛麻醉大鼠，收集大鼠肺泡灌洗液，取右肺于4%多聚甲醛内固定，用于组织学和免疫组织化学分析，取左肺放于-80℃冰箱保存，用于蛋白质印迹检测。肺组织中羟脯氨酸含量和BALF中TGF-β1水平检测具体操作分别按照试剂盒说明书进行。

1.6 组织学检测 将肺组织常规固定，脱水透明，石蜡包埋，切片后进行组织学染色。HE染色：充分烤片后脱蜡水化，苏木精染液3 min，流水冲洗，盐酸酒精分化3 s，自来水冲洗15 min，伊红染液2 min，蒸馏水洗，梯度酒精脱水，透明，中性树胶封片。Masson染色操作步骤按照试剂盒说明书进行。采用免疫组织化学方法检测大鼠肺组织中TRPV1表达水平。充分烤片后，脱蜡水化，抗原修复，灭活内源性过氧化物酶，封闭，一抗孵育，二抗孵育，DAB显色，苏木素复染，脱水，中性树胶封片。

1.7 组织学分析 使用Szapiel法评价肺泡炎和肺纤维化程度，根据HE染色结果对肺泡炎程度进行评分。0分：无肺泡炎；1分：轻度肺泡炎，病变范围占全肺20%以下，肺泡间隔因炎症细胞浸润而增宽，病变局限；2分：中度肺泡炎，病变范围占全肺的20%～50%，近胸膜处受累更严重；3分：中度肺泡炎，病变范围超过全肺的50%，呈弥漫性分布。根据Masson染色结果对纤维化程度进行评分。0分：无肺纤维化；1分：轻度肺纤维化，纤维化范围占全肺20%以下，胸膜和胸膜下间质受累，存在肺泡结构紊乱；2分：中度肺纤维化，纤维化范围占全肺的20%～50%；3分：重度肺纤维化，纤维化范围超过全肺的50%，呈弥漫性分布。

1.8 蛋白质印迹检测 采用蛋白质印迹检测大鼠肺组织中α-SMA、Ⅰ型胶原蛋白和TRPV1蛋白的表达水平。提取肺组织总蛋白，BCA法检测蛋白浓度，SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳，转印至PVDF膜，脱脂牛奶封闭，一抗孵育过夜，二抗孵育，ECL法显色，以GAPDH为内参，应用Image J软件对条带灰度值进行分析。

1.9 统计学分析 采用SPSS 20.0软件，实验结果以±s表示，经方差齐性检验和正态性检验后，采用单因素方差分析进行比较，组间多重比较采用LSD-t检验。P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 一般状况 首次气管灌注后，对照组大鼠活动正常，皮毛光亮，呼吸平稳，精神状态尚可，饮水、进食量略少于灌注前，1周后恢复；模型组大鼠活动减少，皮毛光泽差，呼吸急促，精神萎靡，饮水、进食量明显少于灌注前，2周后恢复；CPZ干预组大鼠一般状况较对照组略差，但较模型组有所改善。首次灌注后2周内，各组大鼠体质量均出现增长缓慢，以模型组最明显；第2周后，各组大鼠体质量逐渐恢复增长，各组大鼠体质量差异无统计学意义。见表1。

2.2 肺组织病理学变化

2.2.1 肺泡炎程度 HE染色结果显示，对照组大鼠肺泡结构基本完整，肺泡和间质仅有少量炎症细胞浸润，肺泡间隔未见增厚；模型组大鼠定期吸入胃液导致肺泡结构破坏明显，肺泡间隔增宽，大量炎症细胞浸润，成纤维细胞增生，可见纤维组织形成和胶原沉积；CPZ干预组大鼠虽然存在肺泡结构破坏和炎症细胞浸润，但病理改变程度与模型组相比明显改善。量化肺泡炎程度，模型组肺泡炎评分高于对照组 (t=5.79，P＜0.01)，而CPZ干预组评分比模型组明显降低 (t=-2.17，P＜0.05)。见图1、2。

表1 3组大鼠不同时间体质量变化 (g，±s)

表1 3组大鼠不同时间体质量变化 (g，±s)

组别 鼠数 0周 2周 4周 6周 8周对照组 10 208.6±12.1 216.3±8.4 249.2±8.1 267.0±15.8 302.8±17.8模型组 10 204.0±11.2 204.2±13.9 239.6±19.9 264.4±15.7 296.1±16.1辣椒平干预组 10 205.7±9.6 210.4±7.9 240.5±10.3 264.9±16.2 297.8±12.6 F值 0.450 3.367 1.485 0.075 0.495 P值 0.645 0.049 5 0.244 0.928 0.615

图1 各组大鼠肺泡炎程度 HE ×100 A：对照组；B：模型组；C：辣椒平干预组

图2 各组大鼠肺泡炎评分

2.2.2 肺组织纤维化程度 Masson染色结果显示，对照组大鼠肺泡结构完整，仅有少量胶原沉积；模型组大鼠肺泡结构破坏严重，肺泡壁增厚，细胞外基质增多，肺泡及气管周围有大量胶原沉积，肺纤维化评分显著高于对照组 (t=6.91，P＜0.01)；与模型组比较，CPZ干预组纤维化程度显著改善，肺纤维化评分明显降低 (t=-2.54，P＜0.05)。见图3、4。

图3 各组大鼠肺纤维化评分

图4 各组大鼠肺组织纤维化程度 Masson ×100 A：对照组；B：模型组；C：辣椒平干预组

2.3 肺组织中α-SMA及Ⅰ型胶原蛋白的表达蛋白质印迹结果表明，模型组大鼠肺组织中α-SMA表达显著高于对照组 (t=3.46，P＜0.01)，而CPZ干预组大鼠肺组织中α-SMA表达与模型组相比下降 (t=-2.11，P＜0.05)；与对照组比较，模型组大鼠肺组织中Ⅰ型胶原蛋白表达升高 (t=5.61，P＜0.01)，而CPZ干预组大鼠肺组织中Ⅰ型胶原蛋白表达较模型组降低 (t=-2.33，P＜0.05)。见图5。

图5 蛋白质印迹检测各组大鼠肺组织中α-平滑肌肌动蛋白及Ⅰ型胶原蛋白表达水平 A：电泳图；B：柱状图

2.4 肺组织中羟脯氨酸含量 与对照组比较，模型组大鼠肺组织中羟脯氨酸含量明显增加 (t=11.75，P＜0.01)，CPZ干预组大鼠肺组织中羟脯氨酸含量较模型组降低 (t=-4.81，P＜0.01)。见表2。

表2 各组大鼠肺组织中羟脯氨酸含量 (±s)

表2 各组大鼠肺组织中羟脯氨酸含量 (±s)

注：与对照组比较，a P＜0.01；与模型组比较，b P＜0.01

组别 鼠数 羟脯氨酸 (mg/g)对照组 10 0.30±0.07模型组 10 0.74±0.06a辣椒平干预组 10 0.56±0.12b F值 69.78 P值 ＜0.0001

2.5 肺组织中TRPV1的表达 免疫组织化学结果显示，与对照组比较，模型组TRPV1表达水平显著增加 (t=9.31，P＜0.01)，利用CPZ抑制TRPV1后，大鼠肺纤维化明显改善 (图6、7)。蛋白质印迹检测也呈现相似的趋势 (图8)。

图6 免疫组织化学检测各组大鼠肺组织中TRPV1表达水平 ×200 A：对照组；B：模型组；C：辣椒平干预组

图7 各组大鼠肺组织中TRPV1表达水平

2.6 BALF中TGF-β1水平 结果显示，与对照组相比，模型组大鼠BALF中TGF-β1明显增加(t=15.16，P＜0.01)；与模型组比较，CPZ干预组BALF中TGF-β1水平下降 (t=-8.29，P＜0.05)。见表3。

3 讨论

肺纤维化特征性病变是细胞损伤后进一步组织重塑导致的肺泡结构破坏，肺组织细胞外基质过度沉积所致的纤维化变性[11]。IPF是最常见的肺纤维化类型，是一种进行性、致死性疾病，5年生存率仅为20%[12]。1982年Osler提出胃酸反流和哮喘之间的联系后，胃酸反流被认为是多种呼吸系统疾病的危险因素[13]。越来越多的研究发现，IPF可能与长期误吸胃内容物有关，并通过食管p H值监测证实，IPF患者GERD发病率远高于健康人[14-16]。

图8 蛋白质印迹检测各组大鼠肺组织中TRPV1表达水平 A：电泳图；B：柱状图

表3 各组大鼠BALF中TGF-β1水平 (±s)

表3 各组大鼠BALF中TGF-β1水平 (±s)

注：TGF-β1为转化生长因子β1；与对照组比较，a P＜0.01；与模型组比较，b P＜0.05

组别 鼠数 TGF-β1(ng/L)对照组 10 175.03±45.00模型组 10 609.10±81.75a辣椒平干预组 10 371.70±59.96b F值 115.20 P值 ＜0.000 1

本实验通过向大鼠气道内注入胃液，模拟胃食管反流引起大鼠误吸胃液的模型，发现连续8周灌注胃液的模型组大鼠肺泡结构紊乱，肺泡壁增厚，肺泡炎评分明显高于对照组，Masson染色发现模型组大鼠肺组织细胞外大量胶原沉积，通过Szapiel法量化大鼠肺组织纤维化程度，误吸胃液的模型组大鼠肺纤维化评分显著高于对照组。当成纤维细胞转化为肌成纤维细胞时，便可分泌α-SMA。本研究对纤维化的标记物α-SMA及Ⅰ型胶原蛋白进行了检测，通过蛋白质印迹检测发现，误吸胃液的模型组大鼠α-SMA及Ⅰ型胶原蛋白显著高于对照组[17]。此外，羟脯氨酸是胶原蛋白的主要成分之一，反映组织胶原代谢情况。本研究通过检测各组大鼠肺组织中羟脯氨酸含量发现，模型组大鼠肺组织中羟脯氨酸含量明显高于对照组。这些结果均表明，误吸胃液导致大鼠发生肺纤维化。

目前认为，胃酸反流主要通过酸性物质的直接损伤和激活迷走神经介导的反射引起呼吸系统疾病[13]。已有文献报道[18]，TRPV1参与了胃食管反流通过神经反射引起的气道神经源性炎症，但TRPV1是否参与到误吸反流物直接损伤肺组织引起肺纤维化的过程，尚不清楚。早在1998年，Tominaga等[19]证实，细胞外低p H值可激活TRPV1离子通道，提示误吸到肺部的酸性胃内容物可能通过激活TRPV1促进肺纤维化发生。本实验发现，长期误吸酸性胃液的大鼠不但发生了肺纤维化，免疫组织化学和蛋白质印迹结果显示其肺组织内TRPV1表达水平高于对照组，利用CPZ阻断TRPV1后，误吸胃液的大鼠肺组织中α-SMA、Ⅰ型胶原蛋白及羟脯氨酸含量较模型组显著降低，肺纤维化程度明显改善，这表明TRPV1参与了误吸胃液导致的肺纤维化发生过程。

TGF-β1是关键的促纤维化因子，TGF-β1通过磷酸化其下游的Smad2/3信号通路，触发促纤维化基因的过度表达，参与心、肝、肾、肺等多种器官的纤维化过程[11]。有文献报道IPF患者气道上皮细胞和成纤维细胞中TGF-β增加[20]，本研究结果与既往研究一致。酶联免疫吸附试验方法检测各组大鼠BALF中TGF-β1发现，与对照组相比，气管内注入胃液的模型组大鼠BALF中TGF-β1水平显著增加，而腹腔注射CPZ抑制TRPV1后，大鼠BALF中TGF-β1下降。这些结果均表明，TRPV1的激活在误吸胃液引起大鼠肺纤维化过程中起促进作用，而使用TRPV1抑制剂CPZ可显著改善大鼠肺纤维化。

本研究首次提出了TRPV1在误吸胃液所致肺纤维化过程中的重要作用，提示TRPV1可能为合并胃食管反流的IPF患者提供新的治疗靶点。

利益冲突所有作者均声明不存在利益冲突