胃炎宁颗粒质量标准研究

朱家红 ，陈 贇 ，王影超，杨 勇 ，郭延红，冯 胜

(1.贵阳护理职业学院，贵州 贵阳550081；2.贵州省食品药品检验所，贵州 贵阳 550004； 3.贵阳市第四人民医院，贵州 贵阳 550002)

胃炎宁颗粒由檀香、木香(煨)、细辛、肉桂、赤小豆、鸡内金、甘草(蜜炙)、山楂、乌梅、薏苡仁(炒)十味药材组成，具有温中醒脾、和胃降逆、芳香化浊、消导化食的功效，临床用于伤食湿重引起的胃脘痛、泛酸、恶心及消化不良的治疗。目前，胃炎宁颗粒的质量控制方法为国家食品药品监督管理局颁布的WS3-B-0774-91，仅有显微鉴别及常规项目检查。为更全面地控制胃炎宁颗粒的质量，保证临床用药安全，本研究建立了该制剂中甘草和薏苡仁的薄层鉴别方法，以及甘草中甘草苷和甘草酸的含量测定方法，现报道如下。

1 仪器与试药

1.1 仪器

薄层色谱自动点样仪及照相系统(CAMAG ATS Ⅲ)；高效液相色谱仪(Thermo U3000和Agilent 1260 )；电子天平(METTLER TOLEDO)；超纯水机(UPW-50N)；KQ-500DA型数控超声波提取仪。

1.2 试剂与试药

乙腈(色谱纯，美国天地有限公司)；磷酸(色谱纯，天津光复精细化工研究所，批号28080705)；石油醚(分析纯，天津富宇细化工有限公司，批号20180415)；甲醇(分析纯，天津富宇精细化工有限公司，批号：20180928)；其余试剂均为分析纯。

甘草对照药材(120904-201620)、薏苡仁对照药材(121254-201203)、薏苡仁对照提取油(11750-201703)、甘草苷对照品(111610-201106以93.0%计)、甘草酸铵对照品(110731-201619以93.7%计)均由中国食品药品检定研究院提供。硅胶G板(安徽良臣硅源材料有限公司，批号：20170815)；胃炎宁颗粒样品分别来自山东孔府制药有限公司(20180403)、湖北老中医制药有限责任公司(20180415)、长春人民药业集团有限公司(20180402)、吉林亚泰明星制药有限公司(20180413)。

2 方法与结果

2.1 薄层色谱鉴别

2.1.1 甘草薄层色谱鉴别[1-3]取样品(批号为20180415)15 g，研细，加甲醇50 mL，超声提取功率(100 kW)30 min，滤过，滤液挥干，残渣加水20 mL使其溶解，加乙醚30 mL振摇提取，弃去乙醚液，水液用水饱和的正丁醇振摇提取2次，每次30 mL，合并正丁醇液，回收溶剂至干，残渣加乙醇1 mL使其溶解，作为供试品溶液。另取甘草对照药材1 g，同法制成对照药材溶液。取缺甘草的阴性样品，按供试品溶液制备方法，制得阴性对照溶液，按照薄层色谱法(通则0502)试验，吸取上述溶液0.5～1 μL，分别点于同一硅胶G薄层板上，以乙酸乙酯-甲酸-冰醋酸-水(15∶1∶1∶2)为展开剂展开，取出，晾干，喷以10%硫酸乙醇溶液，105 ℃加热至斑点显色清晰，置于紫外光灯(365 nm)下检视。供试品色谱中，在与对照药材色谱相应的位置上，显相同颜色的荧光主斑点，阴性样品无干扰。见图1。

1.阴性样品；2.甘草对照药材(120904-200512)；3.样品(长春人民药业集团有限公司，批号20180402)；4.样品(湖北老中医制药有限责任公司，批号20180415)；5.样品(吉林亚泰明星制药有限公司，批号20180413)；6.样品(山东孔府制药有限公司，批号20180403)(紫外灯光365 nm下检视，温度21 ℃、相对湿度53%)

图1 甘草薄层色谱

2.1.2 薏苡仁薄层色谱鉴别[1，4-7]取样品(批号为20180415)10 g， 研细，加石油醚(60～90 ℃)50 mL，超声提取(100 kW)30 min，滤过，滤液浓缩至3 mL，作为供试品溶液，另取薏苡仁对照药材1 g，同法制成对照药材溶液。再取薏苡仁油对照提取物，加石油醚(60～90 ℃)制成1 mL含2 mg对照药材的溶液，作为对照提取物溶液。取缺薏苡仁的阴性样品，按供试品溶液制备方法，制备阴性对照溶液，按照薄层色谱法(通则0502)试验，吸取供试品溶液5 μL、对照药材和对照提取物溶液各1 μL，分别点于同一硅胶G薄层板上，以石油醚(60～90 ℃)-乙醚-冰醋酸(8∶2∶0.1)为展开溶液展开，取出，晾干，喷以10%硫酸乙醇溶液，105 ℃加热至斑点显色清晰。供试品色谱中，在与对照药材色谱和对照品提取物色谱相应的位置上，显相同颜色的斑点，阴性样品无干扰。见图2。

1.阴性样品；2.薏苡仁对照药材(121254-201203)；3.薏苡仁对照品提取物(11750-201703)；4.样品(长春人民药业集团有限公司，批号20180402)；5.样品(湖北老中医制药有限责任公司，批号20180415)；6.样品(吉林亚泰明星制药有限公司，批号20180413)；7.样品(山东孔府制药有限公司，批号20180403)。(日光下检视，室温20 ℃，相对湿度20%)

图2 薏苡仁薄层色谱

2.2 甘草含量测定

2.2.1 色谱条件及系统适用性试验 色谱柱：Waters XBridge C18色谱柱(4.6 mn×250 mm，5 μm)，流动相：乙腈-0.05%磷酸溶液，梯度洗脱程序见表1。检测波长：273 nm，流速：1.0 mL/min，柱温：30 ℃。理论塔板数按甘草苷计应不低于5 000。

表1 二元梯度洗脱程序 (%)

2.2.2 溶液制备 ①供试品溶液：取胃炎宁颗粒(批号：20180415)适量，研细，取0.25 g，精密称定，置于具塞锥形瓶中，精密加入70%乙醇25 mL，密塞，称定重量，超声提取(100 Kw)20 min，放冷，再称定重量，用70%乙醇补足减失的重量，摇匀，用0.45 μm微孔滤膜过滤，取续滤液即得；②取缺甘草药材的阴性样品，制备阴性对照品溶液；③对照品溶液：精密称定甘草苷(2.707 mg)、甘草酸铵对照品(3.493 mg)，分别置于不同容量瓶中，加70%乙醇稀释至刻度，制成每1 mL含上述2种成分依次为0.253 6、0.324 8 mg的单一对照品贮备液。

2.2.3 方法学考察 (1)专属性试验。取“2.2.2”项下3种溶液，按照拟定的色谱条件进样，记录色谱峰。结果供试品溶液和对照品溶液在相同保留时间处有色谱峰，阴性样品无干扰，且分离度较好，表明方法专属性好。详见图 3。

1.甘草苷；2.甘草酸 A.对照品溶液；B.样品溶液；C.阴性对照品溶液

(2)线性关系考察。精密量取“2.2.2”项下对照品贮备液各1 mL，置于同一10 mL量瓶中，加70%乙醇稀释至刻度，摇匀，依次进样1 μL、5 μL、10 μL、15 μL、20 μL；再精密量取上述对照品贮备液各1 mL，置于同一2 mL量瓶中，摇匀。 进样量10 μL，按上述色谱条件分别进样测定，以进样量(X)为横坐标，峰面积为(Y)纵坐标绘制标准曲线，计算回归方程和相关系数(见表2)。结果表明，2种成分在各自的浓度范围内与峰面积积分线性关系良好。

表2 两种指标成分的线性关系和范围

(3)精密度考察。精密吸取甘草苷(0.253 6 mg/mL)、甘草酸铵(0.318 3 mg/mL)的对照品混合溶液10 μL，重复进样6次，结果甘草苷峰面积RSD为0.56%(n=6)，甘草酸峰面积RSD为0.11%(n=6)，表明仪器精密度良好。

(4)重复性试验。取同一批(批号为20180415)样品，按照“2.2.2”项下方法制备供试品溶液6份，按拟定色谱条件测定，结果甘草苷与甘草酸的平均含量分别为0.309 5 mg/g、0.374 9 mg/g，RSD分别为1.17%(n=6)、1.06%(n=6)，表明方法重复性良好。

(5)稳定性试验。取同一批供试品溶液(批号为20180415)，分别于放置0、4、8、10、13、21、24 h时进样，测定甘草苷的峰面积，结果RSD为 0.669 8%(n=6)；测定甘草酸的峰面积，结果RSD为0.358 2%(n=6)。表明供试品溶液在24 h内稳定。

(6)加样回收试验。取样品(批号为20180415，甘草苷含量为0.386 9 mg/g，甘草酸含量为0.468 6 mg/g)6份，精密称定，每份0.25 g，置于具塞锥形瓶中，精密加入甘草苷(0.384 076 3 mg)和甘草酸铵(0.475 95 mg)的混合对照品溶液 25 mL，按照“2.2.2”项下方法制备供试品溶液，进样测定，计算回收率。结果见表3。

表3 甘草苷和甘草酸加样回收试验结果 (n=6)

(7)样品测定。按照“2.2.1”项下色谱条件，分别测定4批样品，结果见表4。

表4 不同厂家胃炎宁颗粒中甘草苷和甘草酸含量 (mg/袋)

3 讨论

3.1 定性鉴别

参考《中国药典》及有关文献，方中乌梅、山楂的主要成分均为枸橼酸[1]，无法确定专属性，目前国内也没有相应研究，故不选择这两种进行研究。根据工艺方法得知檀香、木香(煨)细辛、肉桂的有效成分均为挥发油，曾测得木香的主要成分木香烃内酯和去氢木香烃内酯含量太低，考察认为在方中挥发油药材占比低，且在生产中损失比较大，故不选择木香作为研究对象。

甘草薄层板：考察了2015版《中国药典》甘草的薄层板，即1%氢氧化钠的硅胶G板，分离效果不好，故改用硅胶G板，分离效果好，斑点清晰。

薏苡仁展开剂选择：以石油醚(60～90 ℃)-乙酸乙酯-醋酸(10∶3∶0.1)为展开剂展开，Rf值小，分离效果不好，故选择石油醚(60～90 ℃)-乙醚-冰醋酸(10∶2∶0.1)为展开剂，阴性样品无干扰，分离效果好。

薏苡仁的观察条件选择：参考2015版《中国药典》薏苡仁的薄层鉴别，喷以5%香草醛硫酸溶液，在105 ℃加热至斑点清晰，使用以后斑点不明显，故选择10%硫酸乙醇溶液，在105 ℃加热，置于紫外灯(365 nm)下检视，斑点清晰，分离度好，无干扰。

3.2 含量测定

提取溶剂与方法：根据甘草苷、甘草酸的理化特性，选择甲醇、乙醇、70%乙醇为提取溶剂，超声提取，以70%乙醇提取效率最高，杂质对主峰无干扰，峰型对称，故本实验选择70%乙醇为提取溶剂。再对70%乙醇超声提取和回流提取的效率进行考察，结果显示，两种提取方式效率无明显差异，且超声提取操作简单，故最终选择超声提取。

提取温度与时间：考察了提取时间对提取效率的影响，结果显示，提取时间超过 20 min时提取效率变化不明显，故选择超声 20 min 提取。

流动相及检测波长：曾参考文献[2]采用乙腈-0.017 mol/L磷酸水溶液-三乙胺( 35∶65∶0.3) 作为流动相测定甘草酸铵( 实际测得峰是甘草酸的峰，再按系数折算成甘草酸铵，即甘草酸铵的量=甘草酸的量×1.020 7) ，结果未出峰，原因是流动相偏碱性，甘草酸铵无法水解成甘草酸，故最终选择乙腈(A)-0.05%磷酸水溶液(B)为流动相，梯度洗脱(0 min时82%B，8 min时82%B，35 min时50%B，36 min时0%B，45 min时82%B )。本试验中选择 273 nm 为甘草苷与甘草酸铵的检测波长。