不同提取工艺对制何首乌含量的影响研究

董 鑫，左亚妹，李 敏，曹建军

(亚宝药业集团股份有限公司，山西 运城 044600)

何首乌为蓼科植物何首乌PolygonummultijiorumThunb.的干燥块根，具有解毒、消痈、润肠通便之功效，主要活性成分包含蒽醌类、二苯乙烯苷类、黄酮类、磷脂类等[1，2]。制何首乌为何首乌经黑豆汁制后的炮制加工品，具有补肝肾、益精血、乌须发、强筋骨、化浊降脂等功效[3，4]。其中，2，3，5，4’-四羟基二苯乙烯-2-O-β-D-葡萄糖苷(简称二苯乙烯苷，TSG)是何首乌最具代表的特征性成分，有降低胆固醇、增强免疫、抗骨质疏松、保肝等功效[5]，已被 2015 年版《中国药典》作为何首乌质量控制的指标性成分。在工业化大生产中，提取、干燥方式的不同，工艺参数控制情况，都会影响制何首乌中二苯乙烯苷的含量；为尽可能减少二苯乙烯苷的破坏，提高含量，本研究采用不同的提取及干燥方式得制何首乌干膏粉，以二苯乙烯苷为指标，进行了含量测定，以确定最佳的提取工艺，为工业化生产提供理论依据。

1 仪器与药品

1.1 仪器

Agilent 1260高效液相色谱仪(美国Agilent公司)；RE 52-99 型旋转蒸发仪(上海亚荣生化仪器厂)；KQ-3200DE 型数控超声波清洗器(昆山市超声仪器有限公司)；电子天平(塞多利斯科学仪器有限公司)。

1.2 试药

二苯乙烯苷(中国食品药品检定研究院，110844-201411，含量，93.2%)；乙腈(色谱纯，Fisher 公司)；磷酸二氢钾(分析纯，国药集团化学试剂有限公司)。

制何首乌药材由亚宝药业集团股份有限公司购买自安徽易元堂中药饮片科技有限公司(批号：20170101，含量，以2.3.5.4’-四羟基二苯乙烯-2-0-β-D葡萄糖苷(C20H22O9)计，2.21%；批号：20170301，含量，以2.3.5.4’-四羟基二苯乙烯-2-0-β-D葡萄糖苷(C20H22O9)计，2.03%；批号：20170501，含量，以2.3.5.4’-四羟基二苯乙烯-2-0-β-D葡萄糖苷(C20H22O9)计，2.09%)，均经质检科鉴定复核。

2 方法与结果

2.1 制何首乌提取方法

2.1.1 70%乙醇提取 制何首乌药材破碎，每份称取300 g。加70%乙醇回流提取3次，每次加4倍量，提取时间分别为2 h、1 h、1 h，合并提取液，过滤，减压浓缩回收乙醇，得浸膏1(相对密度1.00～1.10)，备用，平行制备3份。

2.1.2 水提醇沉 参照安神补脑胶囊国家食品药品监督管理局标准，制何首乌药材破碎，每份称取300 g。加饮用水煎煮两次，每次加12倍量，每次2 h，合并提取液，过滤，减压浓缩至相对密度为1.25～1.32(50 ℃)的浸膏，放凉至室温后缓缓加入乙醇，使含醇量达到50～55%，搅匀，静置24 h，过滤，滤液回收乙醇，浓缩至原浸膏量。放凉至室温后缓缓加入乙醇，使上述浸膏含醇量至60%～65%，静置24 h，过滤，滤液回收乙醇，得浸膏2(相对密度1.00～1.10)，备用，平行制备3份。

2.2 制何首乌干燥方法

将上述所得浸膏1，浸膏2，各取100 g，分别采用真空干燥箱(60～75 ℃，0.04～0.08 MPa，12～24 h)和微波干燥(30～40 ℃，60～70 min)进行干燥，粉碎，得干膏粉。

2.3 含量测定

2.3.1 色谱条件 色谱柱：ZORBAX SB-C18柱 (250 mm ×4.6 mm，5μm)；流速：1.0 mL·min-1；流动相：乙腈(A)-0.02 mol·L-1磷酸二氢钾溶液(B)(25∶75)；检测波长：320 nm；柱温：30 ℃；进样量：20 μL；理论板数按2，3，5，4’-四羟基二苯乙烯-2-O-β-D-葡萄糖苷峰计算大于5 000。

2.3.2 对照品溶液的制备 精密称取2，3，5，4’-四羟基二苯乙烯-2-O-β-D-葡萄糖苷对照品12.5 mg，置50 mL 棕色容量瓶中，加稀乙醇溶解并稀释至刻度，摇匀。分别精密量取2 mL、4 mL、6 mL、8 mL、10 mL，置50 mL 棕色容量瓶中，用稀乙醇稀释至刻度，配成浓度分别为10 μg/mL、20 μg/mL、30 μg/mL、40 μg/mL、50 μg/mL的对照品溶液。

2.3.3 供试品溶液的制备 取干膏粉约0.1 g，精密称定，置具塞锥形瓶中，加三氯甲烷50 mL，超声处理(功率250 W，频率25 kHz)20 min，滤过，弃去滤液，药渣挥干溶剂，连同滤纸一同放回具塞锥形瓶中，精密加入稀乙醇50 mL，精密称量，超声处理30 min，取出，放冷，再称定重量，以稀乙醇补足减失的重量，取上清液用微孔滤膜(0.45 μm)滤过，取续滤液，即得。

2.3.4 标准曲线的建立 按“2.3.1”项下色谱条件，分别吸取“2.3.2”项下标准溶液20 μL，注入高效液相色谱仪，测定峰面积。回归方程为：Y=752.8X+2.363，R2=0.999 6，结果表明二苯乙烯苷浓度为10～50 μg/mL时，浓度与峰面积呈良好的线性关系。见图1、图2和表1。

图1 二苯乙烯苷对照品色谱

图2 制何首乌干膏粉色谱

浓度积分回归方程R2浓度范围10μg/mL20μg/mL30μg/mL40μg/mL50μg/mL755.231 510.442 265.652 996.873 776.21Y=752.8X+2.3630.999610～50μg/mL

2.3.5 精密度检验 按“2.3.1”项下色谱条件，吸取对照品溶液20 μL，连续进样5次，记录峰面积。结果显示，二苯乙烯苷峰面积的RSD为0.28%，精密度好。

2.3.6 重复性检验 取同一干膏粉样品6份，分别按照“2.3.3”项条件制成供试品溶液，按“2.3.1”项色谱条件测定，结果显示，6份样品的二苯乙烯苷峰面积的RSD为1.47%，重复性好。

2.3.7 稳定性检验 取一干膏粉样品，按照“2.3.3”项条件制成供试品溶液，放置0、2、4、8、12、24 h，按“2.3.1”项色谱条件测定，结果显示，二苯乙烯苷峰面积的RSD为1.02%，供试品溶液在24 h内稳定性良好。

2.3.8 加样回收率实验 取已知含量的干膏粉样品6份，精密称定，添加对照品溶液2 mL，平均回收率为99.7%，RSD为1.86%，表明此方法回收率良好。

2.4 不同提取方式的浸膏得率

计算不同提取方式所得浸膏的浸膏得率，70%乙醇提取浸膏得率明显高于水提醇沉，P<0.05，具有统计学差异。见表2。

提取方式浸膏得率(%)70%乙醇25.64±0.08*水提醇沉15.21±0.75

注：与水提醇沉相比，*P<0.05。

2.5 不同提取及干燥方式对含量的影响

分别对不同提取方式所得浸膏，进行含量测定，结果显示，水提醇沉浸膏含量为(1.80±0.46)%，70%乙醇提取所得浸膏含量为(0.87±0.10)%；水提醇沉略优于70%乙醇，差异无统计学意义(P> 0.05)。

分别对不同干燥方式所得干膏粉中的二苯乙烯苷进行含量测定，结果显示，微波干燥所得干膏粉含量明显高于减压干燥，差异有统计学意义(P<0.05)。见表3。

名称烘干方式含量测量值(%)含量(%)P水提醇沉干膏粉微波干燥(n=3)减压干燥(n=3)11.289.028.595.644.125.349.63±1.45*5.03±0.800.01770%乙醇干膏粉微波干燥(n=3)减压干燥(n=3)7.166.975.233.133.114.326.45±1.06*3.52±0.690.028

注：与减压干燥相比，*P<0.05。

3 结语

有文献报道[5]，何首乌在炮制过程中，化学成分和药理作用都发生了明显的改变，药效也随之改变。何首乌经炮制后，二苯乙烯苷的含量低于生何首乌[6]，且随炮制时间延长和温度升高而降低。

本实验结果表明，70%乙醇提取浸膏得率明显高于水提醇沉，含量略低于水提醇沉，70%乙醇提取更适于工业化生产。微波干燥所得干膏粉含量明显高于减压干燥(P<0.05)；实验过程中，减压干燥温度60～75 ℃，时间12～24 h，受热时间较长，温度较高，而微波干燥受热时间和温度都明显低于减压干燥，故含量较高。

在实际生产中，因70%乙醇提取工序简单，浸膏得率较高，含量略低于水提醇沉，而微波干燥可以减少二苯乙烯苷的损失，故建议在工业化生产中采用70%乙醇对制何首乌进行提取，采用微波干燥法进行烘干，并严格控制干燥温度、时间等参数，可满足生产需求。