复方缬草胶囊挥发油部位的提取工艺优化研究

陈相东，张 冲，邓志权，徐正猛，楼一层

(武汉理工大学 化学化工与生命科学学院，湖北 武汉 430070)

失眠是一种世界范围内的普遍问题，据统计世界各国均存在较多失眠症患者。在这些国家当中巴西、美国、英国、法国等国人口的失眠发病率较高，均在30%以上，其中巴西更是达到40%。我国患失眠症的比例仅为25%，但是由于我国人口基数高，患病人数高达4亿人，患病人数排在世界前列[1-3]。

复方缬草方是湖北省中医院用于治疗失眠的经验方，已有多年的临床应用历史。处方由缬草(ValerianaofficinalisL.)、夏枯草(Subtrib.BrunellinaeBriq)、枣仁(SemenZiziphiSpinosae)、茯神(SclerotiumPoriaeCircumRadicemPini)、半夏(RhizomaPinelliae)、灯心草(MedullaJunci)、炒栀子(FructusGardeniae)等多味中药组成，具有补心养肝、养血安神的作用，常用于治疗心肝血虚引起的头晕、心烦、失眠等症[1]，有着不错的效果。但在制备工艺上有些粗糙，还有许多值得改进的地方。本研究拟采用正交试验法优化复方缬草胶囊的制备工艺，使制得的胶囊药效高，稳定性更好，为后续可能的研究打下基础。

1 材料与仪器

FA-1004型分析天平(METTLER TOLEDO公司)；RE-52A型旋转式蒸(郑州长城科工贸易有限公司)；DHJF-2014型冷凝泵(郑州长城科工贸易有限公司)；SHB-Ⅲ型真空泵(郑州长城科工贸易有限公司)；HB-2型电子控温水浴锅(郑州长城科工贸易有限公司)；KQ-310DE型数字超声清洗器(郑州长城科工贸易有限公司)；GZX-3型真空干燥箱(德国Memmert公司)；HWZ-10B型微波真空干燥箱(德国Memmert公司)；1220型液相色谱仪(美国Agilent公司)；AJC-0501-P型纯水仪(美国艾科浦)。

乙腈(Aladdin科技有限公司，色谱纯)；乙酸乙酯(Aladdin科技有限公司，色谱纯)；甲醇(Aladdin科技有限公司，分析纯)；乙酸龙脑酯标准品(Aladdin科技有限公司，批号21060328)。

2 方法与结果

2.1 挥发油部位的提取

称取100 g缬草药材粉碎成细粉放入加有足量沸石的反应器中，然后倒入药材重量8倍的纯化水，振摇搅拌至药粉完全浸泡于水中，充分吸水后静置30 min待用。此时将反应装置搭好，向提取装置中滴入纯化水直至液面到达0刻度线，斜管处刚好溢流少量纯化水至烧瓶为止。静置结束后开启加热装置让体系达到沸腾状态，保持其沸腾状态适度，当15 min内挥发油液面所在刻度无明显变化时停止加热，静置5 min后打开旋塞让水缓慢滴出，当挥发油层液面上端接近0刻度线时关闭活塞，静置1 h。打开旋塞至油层上端与0刻度线在同一水平线上，其下液面所对刻度即为总提取量。用无水Na2SO4对制得的挥发油进行干燥，滤出后密封放置于棕色干燥器保存备用[4-7]。

2.2 正交试验设计

根据预实验研究，本部分拟选用浸泡时间A、液料比B和提取时间C为考察因素(见表1)，以乙酸龙脑酯提取率(mg·g-1)为考察指标，设计L9(34)型实验进行研究(见表2)，同时按表1在不同实验条件对缬草挥发油进行提取，将得到的复方缬草胶囊挥发油部位进行气相色谱检测，并通过与乙酸龙脑酯标准品测得的标准曲线进行对比和综合分析计算乙酸龙脑酯提取率(mg·g-1)，通过数据分析与比较最终确定实验水平下的最优生产条件[8-10]。

表1 正交实验水平因素

表2 各组正交实验条件

其中：Y为提取率；Cba为乙酸龙脑酯浓度；X为挥发油提取量；n为药材总量。

2.3 乙酸龙脑酯的含量测定

2.3.1 色谱条件 色谱柱Agilent 19091J-413，30.0 μm×320 m×0.25 m弹性石英毛细管柱，最高温度为325 ℃；检测器：氢焰分析器；载气为氮气纯度99.99%，压力为0.1 MPa，尾吹0.05 MPa，流速为1.4 mL/min；进样量为2 μL；汽化室温：280 ℃，色谱柱温度：初始温度50 ℃平衡3 min，之后以8 ℃·min-1升温速度加温至100 ℃。再以17 ℃·min-1速度升温直到加温至不再有信号被检测到(不得超过250 ℃机器上限)。以此方法对制好的对照品与供试品进行检测，经分析计算挥发油部位乙酸龙脑酯的含量。

2.3.2 溶液的制备 对照品溶液的制备：取精密称定后的乙酸龙脑酯标准品加至乙酸乙酯中溶解，定容后得到浓度为0.1 g·mL-1的体系作为母液按实验需求配制对照品。供试品溶液的制备：取缬草药材100 g每组，经上述方法进行挥发油提取，取得到的挥发油0.6 g加入5 mL容量瓶中，加入乙酸乙酯摇匀后定容至5 mL。得到的供试品溶液应严格密封保存至干燥器中，在使用前应用0.22μm滤膜过滤后再进行检测。

2.3.3 专属性考察 精密吸取对照品，供试品溶液各10 μL，在上述色谱条件下测定，结果见图1，在相同保留时间上均有对应峰(即乙酸龙脑酯)，可知其他成分对测定结果没有影响。

2.3.4 线性关系考察 将上述待用母液按需求分别进行定量稀释，制成浓度为0.02 g·mL-1、0.04 g·mL-1、0.06 g·mL-1、0.08 g·mL-1、0.10 g·mL-1的对照组溶液。用注射器分别取上述各组溶液用0.22 μm微孔滤膜进行过滤，各浓度组依次取1 μL作为对照品加至气相色谱中按上述测试方法进行测试，实验数据如表3所示。通过统计与回归分析得到回归方程为：y=5141923.35x+ 2889.55，R2=0.9998，其中X为浓度值，Y为峰面积。标准品GC图如图1所示，标准曲线见图2。上述结果表明当对照组浓度为0.02～0.10 g·mL-1范围内时，溶液浓度与各组峰积分面积呈现出线性关系，可以用此方程进行分析计算。

图1 乙酸龙脑酯标准品和供试品GC图谱

表3 对照组实验数据

图2 对照组标准曲线

2.3.5 精密度实验 依照实验组5因素水平进行实验与后续制备，制备产物重复检测6次。各组实验乙酸龙脑酯提取率检测数据如表4所示，6组实验提取率RSD为0.384%，证明此测定方法有着非常好的精密度。

表4 精密度实验结果

2.3.6 稳定性实验 取实验组5样品于第0 h、6 h、12 h、24 h、48 h、72 h时依次检测，计算各组实验乙酸龙脑酯提取率(表5)。经计算提取率RSD为1.721%，表明本方法稳定性良好。

表5 稳定性实验结果

2.3.7 重复性实验 按“2.1”项下的方法对同一批样品提取挥发油共6次，将所得挥发油依次配制为供试品溶液并按上述检测方法进行检测，计算各组实验乙酸龙脑酯提取率(表6)。应用本法提取率RSD为1.326%，证明本检测方法可以非常好地被重复，可以作为一种标准测试手段。

表6 重复性实验结果

2.3.8 加样回收率实验 取六组相同体积样品，各含0.053 0 mg标准品，依次加入0.02 mg、0.02 mg、0.04 mg、0.04 mg、0.05 mg、0.05 mg乙酸龙脑酯标准品，超声处理使其完全溶解。按上述检测方法进行检测，根据乙酸龙脑酯含量计算各组加样后的总回收率，实验数据如表7所示。数据显示各组实验回收率均趋近于100%水平，RSD值为1.622%，表明本法作为一种含量测定方法具有非常好的准确性，在标准浓度范围内回收率满足要求。

表7 加样回收实验数据

2.4 正交试验

取各实验组供试样品2 μL依次按“2.3”项下方法进行检测，实验数据统计与分析见表8、表9。

表8 直观分析数据

表9 方差分析数据

根据以上数据进行分析可知：各因素R值分别为：0.254、1.560、7.747，RC>RB>RA，故各因素对提取率影响程度的重要性为C>B>A。根据表9中方差分析结果F值情况，可知因素C具有显著性，而因素B的F值远大于A，但它们都不具有显著性。提取率为正向优势数据，因此同一因素中k值大代表条件为优。经过上述分析A2B2C3为最佳条件。由于条件A即浸泡时间对提取率没有显著性影响且各组条件下数据差别不大，从减少实验所用时间的角度来讲，应选择浸泡过程较短的0.5 h做为工艺的最优浸泡条件。条件B的改变也对实验结果没有显著影响，但当液料比为10∶1时，其K值相较于8∶1与12∶1均更高，与此同时考虑到对药材更好浸泡等因素最终选择最优的B2条件即10∶1作为最优的液料比。实验条件C，即提取时间对提取率有显著性影响且随提取时间增长提取率也在增长，故选择C3条件即提取5 h作为最优的挥发油提取工艺。最终确定以10倍量的纯化水加至药材中，浸泡0.5 h后进行挥发油提取，总共提取5 h后收集提取到的挥发油成分并储存备用。由于最终确定的工艺条件与上面提到的A2B2C3条件并不相同，因此决定以两种条件分别各进行三组实验进行比较，考察其是否具有较大的差异性，同时验证工艺的可行性。

2.5 验证实验

为测试上述正交实验优选出的A1B2C3条件是否具有重复性与稳定性，和是否与A2B2C3条件有较大差异，拟分别选用两种条件按照“2.1”项下挥发油提取工艺进行提取实验各3组，记录实验数据并进行分析。实验结果见表10。

表10 工艺验证实验

结果显示，提取按照条件A1B2C3工艺进行提取与条件A2B2C3进行提取乙酸龙脑酯提取率基本一致，差异较小，且RSD为1.064%符合标准，表明本实验方案合理且稳定可行。故最终确定以“将药材细粉加至放有足量沸石的反应器。之后倒入药材重量10倍的纯化水，振摇搅拌至药粉完全浸泡于水中充分吸水后静置30 min待用。开启加热装置让体系达到沸腾状态，保持适度沸腾5 h”作为制备处方挥发油部位的最优实验方案。

3 讨论

挥发油提取技术发展至今已经较为成熟，在这些方法当中水蒸气蒸馏法历史悠久、操作简单高效是最常见的一种技术。诸如萃取法和冷压法等也在其各自优势的领域发挥良好的提取效果。在实验前期通过对方法操作难易程度、需要提取量与现有设备可行性等方面进行综合考量，最终选择使用水蒸气蒸馏法对缬草进行提取。水蒸气蒸馏法的应用最为广泛，方法成熟度较高，相对于溶剂萃取法、冷压法等方法适应性更广、可行性较高。而通过预实验发现缬草挥发油可稳定与水分层且浮于水层之上，证明缬草挥发油密度小于水的密度，可以应用2015版《中国药典》第四部通则2204项下甲法进行实验。

从上述分析可以看出，各因素对提取率影响程度的重要性依次为C>B>A。且因素A的显著性最弱，通过正交实验得到的最优方案为A2B2C3，但考虑到之后中试实验放大带来的影响可能会增加浸泡时间，因此在可能的前提下应尽可能减少浸泡时间，使得整体生产工艺更效率化、经济化。通过对A1B2C3和A2B2C3的验证实验比较，乙酸龙脑酯的提取率几乎没有影响，且RSD值均符合标准，因此最终确定的最佳提取工艺为A1B2C3，即“将药材细粉加至放有足量沸石的反应器。之后倒入药材重量10倍的纯化水，振摇搅拌至药粉完全浸泡于水中充分吸水后静置30 min待用。开启加热装置让体系达到沸腾状态，保持适度沸腾5 h”，这对于之后的中试生产有一定的经济价值。