采用植物代谢组学技术检测不同产地甘草活性成分的含量

刘 谦，李 熙

(河北出入境检验检疫局检验检疫技术中心保定分中心，河北 保定071000)

甘草为豆科甘草GlycyrrhizauralensisFisch.、胀果甘草GlycyrrhizainflataBat.或光果甘草GlycyrrhizaglabraL.的干燥根及根茎，是常用的中药材，性甘，味平，具有补脾益气、清热解毒、祛痰止咳、缓急止痛、调和诸药的功效[1-6]。近年来国内外学者对甘草属植物进行了化学成分的研究，发现其主要有效成分是黄酮类和三萜皂苷成分，还有少量的生物碱、木质素和香豆素等[7-10]。《中国药典》2015 版一部对甘草药材的性状、甘草苷及甘草酸含量采用了显微鉴别、薄层色谱鉴别等检测，以进行质量控制。通过对不同栽培年龄不同产地的甘草进行比较，无论黄酮还是皂苷类成分含量都有较大差异，有些成分含量甚至差异很大。虽然采用HPLC法能对甘草化学成分进行较好的分离，但其主要用于对甘草酸等特定成分进行分析和检测。由于植物代谢产物种类繁多、结构迥异，传统的分析手段难以满足高通量分析的要求，代谢组学技术的出现为这一问题的解决提供了新的方案。代谢组学技术是近十年来发展较快的新兴组学技术，可对生物或细胞内所有小分子代谢产物同时进行定性和定量分析，是系统生物学研究的重要手段。与传统的化学分离模式相比，代谢组学技术可最大程度揭示中药化学成分间的协同作用。本实验采用代谢组学技术和液相色谱质谱联用方法对不同产地甘草的化学成分进行了分析，以中药的整体观和多成分、多靶点协同作用的特点为切入点，充分考虑中药内部化学成分的变化，开展综合质量技术评价，为甘草的规范化种植提供参考依据。

1 实验方法

1.1 仪器和材料

岛津LC-20A高效液相色谱仪，包括SIL-20A自动进样器，LC-20AT二元梯度泵，带PDA的SPD-M20A型紫外检测器；液相色谱-串联质谱仪，配有电喷雾离子源(ESI)；流动相所用乙腈为色谱纯；其他试剂均为分析纯。

1.2 样品处理

取甘草粉末(过3号筛)约0.2 g，精密称定后置具塞锥形瓶中，精密加入70%乙醇100 mL，称定重量，超声处理(功率300 W，频率50 kHz)35 min，放冷，再称定重量，用70%乙醇补足减失的重量，摇匀，滤过，取续滤液，即得。

1.3 色谱条件

色谱柱：Agilent Eclipse XDB-C18不锈钢柱，4.6 mm×250 mm，5 μm 粒径。流动相：梯度洗脱。乙腈：0.05%磷酸溶液/(19-81)至(19-81)，0～8 min；(19-81)至(50-50)，8～35 min；(50-50)至(100-0)，35～36 min；(100-0)至(19-81)，36～40 min。柱温：35 ℃。进样量：10 μL。

1.4 质谱条件

离子源：电喷雾离子源(ESI)；扫描方式：负离子扫描；检测方式：全离子扫描；离子源温度：120 ℃。

2 检测结果

以乙腈、0.05%磷酸溶液为流动相进行线性梯度洗脱可得到较好的高效液相色谱分离效果。在全离子扫描方式下，三萜皂甙、黄酮和香豆素化合物作为甘草中的主要化学成分，其分子中的羟基易形成稳定的氧负离子，在负离子电喷雾的环境下得到的质谱图(图1)。由图1可知，不同类型的化合物其离子响应值有很大的不同。

图1 甘草样品的全离子扫描

三萜皂甙、黄酮和香豆素化合物作为甘草中的主要化学成分，表现出的光谱和质谱特征有很大的区别。黄酮类化合物从结构上来看，准分子离子[M+ Cl]-、[M-H]-和[M+ 97]-非常明显，通过对其结构的分析可判断出，[M+ 97]-是[M+ HSO4]-，这可辅助分子量的确证。在样品的浓度比较高的条件下，[2M-H]-也有可能形成。这些准分子离子是确定该类化合物结构的重要途径。香豆素类化合物与黄酮的准分子离子峰产生的途径比较类似，[M+ Cl]-、[M-H]-和[M+ HSO4]-出现的概率大。而在三萜皂甙类物质的分子结构中含有葡萄糖醛酸，产生的准分子离子也有明显的结构特征。通过对光谱、质谱数据分析并结合文献报道，对甘草分离出的80余个主要峰进行分析，大致确定了40个主要成分的可能结构。鉴定出的化合物的名称、紫外最大吸收、准分子离子峰分析，见表1。

续表1 甘草中的40种主要化学成分

甘草的质量取决于其物质基础，通过对甘肃、新疆、内蒙、宁夏四地的甘草样品进行检测，对比检测结果发现：甘肃、宁夏的西北甘草多含甘草酸、甘草甙、异甘草甙、甘草香豆酮、异甘草黄酮醇、甘草异黄酮甲、甘草黄酮醇、甘草豆精-7-甲醚、甘草西定、甘草利酮、甘草宁F、G、H、I、甘草酚等；新疆甘草含甘草酸、甘草甙、异甘草甙、刺芒柄花素、甘草异黄酮B、甘草素、甘草西定等；内蒙、吉林的东北甘草含甘草酸、甘草甙、异甘草甙、甘草香豆酮、甘草西定、甘草利酮、甘草酚等。本研究通过检测甘草酸、甘草苷、异甘草素、芹糖甘草苷、芹糖异甘草苷、甘草素六种主要的化学成分含量，对不同产地的甘草进行了测定。

2.1 标准曲线的绘制

称取甘草苷对照品 14.8 mg、甘草酸铵对照品 21.2 mg、甘草素对照品18.9 mg、异甘草素17.3 mg、芹糖甘草苷21.0 mg，分别用70%乙醇定容于10 mL 容量瓶中，另称取芹糖异甘草苷4.8 mg，用70%乙醇定容于5 mL容量瓶中，作为对照品储备液。分别精密吸取甘草苷储备液67.6 μL、甘草酸铵储备液47.2 μL、甘草素储备液52.9 μL、异甘草素储备液57.8 μL、芹糖甘草苷储备液47.6 μL、芹糖异甘草苷104.2 μL，用70%乙醇定容至1 mL，作为系列混合标准溶液。分别进样10 μL，记录甘草苷、甘草酸铵、甘草素、异甘草素、芹糖甘草苷和芹糖异甘草苷的峰面积，以峰面积对进样量(μg)进行回归，结果见表2。混合标准系列色谱图，见图2。甘草苷、甘草酸铵、甘草素、异甘草素、芹糖甘草苷、芹糖异甘草苷色谱峰理论塔板数，分别为9千、30万、6万、20万、7千、1万。

表2 不同产地甘草中甘草酸、甘草苷、异甘草素、芹糖 甘草苷、芹糖异甘草苷、甘草素的含量比较 (mg/g)

续表2 不同产地甘草中甘草酸、甘草苷、异甘草素、芹糖 甘草苷、芹糖异甘草苷、甘草素的含量比较 (mg/g)

2.2 稳定性和精密度实验

取甘肃甘草样品一份，按照“1.2”项下方法取得供试品溶液，室温放置，并于0、2、4、6、8、12 h进样，记录色谱图，计算各物质的峰面积进行稳定性实验。取甘肃甘草样品6份，按照“1.2”项下方法取得供试品溶液，同样实验条件下进样，记录色谱图，计算各物质的峰面积，进行精密度实验。

六种标准物质在上述仪器条件下，在5～30 min全部出峰且峰形尖锐而对称，测试结果见图2至图6。图2表示的是六种标准物质出峰的先后顺序色谱，图3至图6分别是甘肃、新疆、内蒙、宁夏的甘草样品的色谱。表2为六种主要成分的检测结果。由稳定性测试结果可知，甘草供试品各色谱峰相对保留时间在12 h内稳定。由精密度实验测试结果可知，精密度均符合标准要求。

图2 甘草酸、甘草苷、异甘草素、芹糖甘草苷、芹糖异甘草苷、甘草素六种物质色谱

图3 甘肃甘草样品的色谱

图4 新疆甘草样品的色谱

图5 内蒙甘草样品的色谱

图6 宁夏甘草样品的色谱

3 讨论

在测定样品中，吉林甘草样品中甘草酸、甘草苷、异甘草素普遍较低，内蒙、甘肃、新疆甘草样品中甘草酸含量较高，而新疆甘草样品甘草酸含量最高，甘草苷的含量以内蒙和甘肃甘草样品为高，异甘草素含量以内蒙甘草样品为高。新疆和内蒙的样品中芹糖甘草苷含量明显高于甘肃和吉林的样品，而甘肃和吉林中芹糖甘草苷含量比较接近，新疆和内蒙的样品中芹糖甘草苷含量比较接近。新疆样品中的甘草素含量最高，明显高于其他三地；内蒙和吉林样品的甘草素含量接近，甘肃样品中甘草素含量最低。四地的芹糖异甘草苷含量相差不大，吉林和甘肃两地的样品更为接近。由此可见，在选定的六种物质中，东北、华北、西北不同产地的甘草样品其含量差异很大，并且表现出一定的规律性和代表性。除此之外，其他甘草的活性成分由于不同地理位置、生长环境、气候条件、种植方式的差异，也呈现出相似的特征。这些都可以作为中药材产地鉴别的参考，可为甘草的规范化种植提供一定的科学依据。