百合配方颗粒HPLC指纹图谱研究

姚 娜，黄燕明，陈桂生，李雪银，康志英

(1.广州市香雪制药股份有限公司，广东 广州 510663；2.隆德县六盘山 中药资源开发有限公司， 宁夏 固原 756300)

百合配方颗粒是以百合饮片为原料，经水提、浓缩、干燥、制粒、包装等工艺制备而成。原料百合为百合科植物卷丹LiliumlancifoliumThunb.、百合LiliumbrowniiF.E.Brown var.viridulumBaker或细叶百合LiliumpumilumDC.的干燥肉质鳞叶，秋季采挖，洗净，剥取鳞叶，置沸水中略烫，干燥。其具有养阴润肺、清心安神的功效，临床上用于阴虚燥咳、劳嗽咳血、虚烦惊悸、失眠多梦、精神恍惚[1-2]。百合是中药的药食同源植物，主要分布于北温带和亚热带地区。百合的鳞茎主要含有甾体皂苷、甾醇、酚酸甘油酯、黄酮、苯丙素、生物碱和多糖类等化合物[3-5]。研究表明，百合具有止咳祛痰、免疫调节、抗肿瘤、抗氧化、抗炎、抗应激损伤、抗抑郁、降血糖及抑菌等药理作用[6-8]。

1 仪器与试药

万分之一电子分析天平(ME204，瑞士Mettler toledo公司)；超纯水器(Simplicity，美国密理博Millipore公司)；数控超声波清洗器(KQ500DE，昆山市超声仪器有限公司)；Agilent1260 高效液相色谱仪(德国Agilent公司，G1311B单四元泵、G1329B自动进样器、G1316A柱温箱、G1315D检测器、OPENLAB CDS ChemStation Edition 数据处理软件)；Dionex Ultimate 3000 高效液相色谱仪(美国Dionex公司，LPG-3400SDN单四元泵、WPS-3000SL自动进样器、TCC-3000RS柱温箱、DAD-3000检测器、Chromeleon7.2数据处理软件)；色谱柱：Agilent Zorbax Eclipse Plus C18(4.6 mm×250 mm，5 μm)、Dikma Diamonsil C18(4.6 mm×250 mm，5 μm)、Welch Ultimate XB-C18(4.6 mm×250 mm，5 μm)。

百合对照药材(中国食品药品检定研究院，121100-201304，规格：1 g)；乙腈、甲酸为色谱级；甲醇为分析纯。

10批百合配方颗粒均来自广州市香雪制药股份有限公司(批号依次为01～10，规格为1.0 g/袋)；麦芽糊精来自湖州展望药业有限公司。

2 方法与结果

2.1 色谱条件与系统适用性试验

参考相关文献[9-11], 以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂(柱长为25 cm，内径为4.6 mm，粒径为5 μm)；以乙腈为流动相A，以0.1%甲酸溶液为流动相B，按表1的规定进行梯度洗脱；检测波长为280 nm；柱温25 ℃；流速为0.6 mL/min。

表1 梯度洗脱程序

2.2 对照溶液制备

取百合对照药材4 g，精密称定，置锥形瓶中，精密加入甲醇50 mL，加热回流1 h，放冷，滤过，滤液浓缩至近干，转移至10 mL量瓶中，加甲醇至刻度，摇匀，滤过，取续滤液，即得。

2.3 供试品溶液制备

取百合配方颗粒约1 g，研细，精密称定，置锥形瓶中，精密加入甲醇25 mL，超声处理15 min(频率40 kHz，功率250 W)，放冷，滤过，滤液浓缩至近干，转移至10 mL量瓶中，加甲醇至刻度，摇匀，滤过，取续滤液，即得。

2.4 测定法

分别精密吸取参照物溶液与供试品溶液各10 μL，注入液相色谱仪，测定，记录色谱图。

2.5 10批样品的检测结果

分别取10批百合配方颗粒，按“2.3”项下方法制备10份供试品溶液，按“2.1”项下的色谱条件测定，得到10批百合配方颗粒的色谱叠加图，采用《中药色谱指纹图谱相似度评价系统2012.1版》对10批百合配方颗粒指纹图谱进行计算，相似度达0.99以上。结果见图1、表2、图2。

图1 10批百合配方颗粒指纹图谱叠加图

批号01020304050607080910对照指纹图谱011.0000.9991.0001.0001.0000.9971.0000.9990.9990.9980.999020.9991.0001.0001.0001.0000.9990.9991.0001.0001.0001.000031.0001.0001.0001.0001.0000.9991.0001.0001.0000.9991.000041.0001.0001.0001.0001.0000.9981.0000.9991.0000.9991.000051.0001.0001.0001.0001.0000.9991.0001.0001.0000.9991.000060.9970.9990.9990.9980.9991.0000.9971.0000.9991.0000.999071.0000.9991.0001.0001.0000.9971.0000.9990.9990.9980.999080.9991.0001.0000.9991.0001.0000.9991.0001.0001.0001.000090.9991.0001.0001.0001.0000.9990.9991.0001.0001.0001.000100.9981.0000.9990.9990.9991.0000.9981.0001.0001.0001.000对照指纹图谱0.9991.0001.0001.0001.0000.9990.9991.0001.0001.0001.000

2.6 指纹图谱中共有峰确认

通过对10批广州市香雪制药股份有限公司生产的百合配方颗粒进行分析，并与百合对照药材进行比对，有6个色谱峰能稳定重现，且峰面积占总面积的比例均大于3%，故确立了6个共有峰。其中，2号峰、6号峰的峰面积占总面积的比例均大于10%，峰纯度较纯，故2、6号峰为特征峰。

图2 百合配方颗粒指纹图谱共有模式

2.7 指纹图谱方法学考察

2.7.1 专属性试验 取百合配方颗粒、麦芽糊精分别按“2.3”项下方法制备，按“2.1”项下的色谱条件测定，结果表明，6个共有色谱峰的鉴定均不受溶剂及辅料等因素干扰，具有良好的专属性。

2.7.2 精密度试验 取同一批百合配方颗粒供试品溶液，按“2.1”项下的色谱条件于高效液相色谱仪上连续进样6次，记录色谱图，采用《中药色谱指纹图谱相似度评价系统2012.1版》进行相似度评价，各图谱共有峰与对照指纹图相似度均大于0.990 0，表明该仪器精密度良好。

2.7.3 重复性试验 取同一批百合配方颗粒样品，平行6份，按“2.3”项下方法制备，按“2.1”项下的色谱条件分别进样，记录色谱图，各图谱特征峰的相似度均大于0.990 0，表明该方法重复性良好。

2.7.4 稳定性试验 取同一份百合配方颗粒供试品溶液，按“2.1”项下色谱条件，分别在0、2、4、6、8、12、24、48 h进样，记录色谱图，结果各图谱共有峰的相似度均大于0.990 0，表明该供试品溶液在48 h内稳定性良好。

2.7.5 中间精密度试验 分别考察不同分析人员、不同日期、不同设备对精密度的影响，结果各图谱共有峰的相似度均达0.9900以上，表明该方法中间精密度良好，随机变动因素不影响该方法精密度。

2.7.6 耐用性实验 取同一批百合配方颗粒供试品，按“2.3”项下方法处理样品，分别使用Agilent Zorbax Eclipse Plus C18(4.6 mm×250 mm，5 μm)、Dikma Diamonsil C18(4.6 mm×250 mm，5 μm)、WelchUltimateXB-C18(4.6 mm×250 mm，5 μm)三种型号的色谱柱，按“2.1”项下的色谱条件分别进样，记录色谱图，结果在不同色谱柱因素变动的条件下，各图谱共有峰的相似度均达0.990 0以上，表明该方法耐用性良好。

3 讨论

本实验对不同实验条件进行优化，考察了乙腈-0.1%磷酸溶液、乙腈-0.1%冰醋酸溶液、乙腈-0.1%甲酸溶液、乙腈-水等流动相体系；柱温分别选用20、25、30 ℃；全波长扫描考察了不同波长下供试品的指纹图谱。最终选取在柱温25 ℃下，检测波长为280 nm，以乙腈-0.1%甲酸溶液梯度洗脱，该条件下谱图色谱峰信息丰富，分离度好，稳定性好。

在色谱柱的选择中，根据百合配方颗粒样品中的成分类别及理化性质，选用C18柱进行分离，分别考察了Agilent Zorbax Eclipse Plus C18(4.6 mm×250 mm，5 μm)、Dikma Diamonsil C18(4.6 mm×250 mm，5 μm)、Welch Ultimate XB-C18(4.6 mm×250 mm，5 μm)三种型号的色谱柱，各色谱峰均能达到基本分离，各型号色谱柱分离效果符合要求。

通过相似度计算软件[12]得到10批百合配方颗粒的对照图谱及各批样品与对照图谱之间的相似度，结果均大于0.990 0，表明各批次样品之间相关性较好，投料所用的百合原药材质量较稳定，百合配方颗粒工艺稳定。

本实验中建立的采用HPLC检测百合配方颗粒指纹图谱方法稳定性、重复性好、简便，能比较全面地反映百合配方颗粒的质量，可作为百合配方内控颗粒质量标准。