翘嘴鲌形态特征及其同工酶电泳分析

张涛，周剑光，陈建武，何力

(农业农村部水产品质量安全风险评估实验室(武汉)，农业农村部淡水鱼类种质监督检验测试中心，中国水产科学研究院长江水产研究所，武汉 430223)

翘嘴鲌(Culteralburnus)隶属鲤形目(Cypriniformes)、鲤科(Cyprinidae)、鲌亚科(Cultrinae)、鲌属(Culter)，在各主要水系的江河、湖泊和水库中均有分布，在鲌亚科鱼类中体型相对较大，在水体中处于中上层，具有体型好、广温性、摄食凶猛、生长快及肉质鲜美等优良性状和较高的经济价值。在经济利益驱动下，野生翘嘴鲌一度被过度捕捞，加之环境污染，部分地区翘嘴鲌天然资源量下降[1-2]。随着翘嘴鲌人工繁殖取得成功以及养殖技术逐渐提高，填充了市场需求，目前在浙江、江苏、湖北及安徽等地区已成为主要养殖品种之一。已有研究表明，翘嘴鲌养殖群体遗传多样性处于较低水平[3]，为防止翘嘴鲌种质资源退化，中国水产育种工作者开展了一系列属内及属间杂交研究，并取得了一定成果[4-7]。

由于不同种鱼类具有不同的形态特征，研究外部形态特征，可通过形态测量获取可数性状和可量性状数据，亦或构建判别方程，可以直观便捷地鉴定鱼的种类[8]。同工酶作为一种生化遗传参数，在鱼类的亲缘关系与分类、物种鉴定中的基因表达与调控研究以及群体遗传结构分析等方面得到广泛的应用[9-10]。在生化遗传标记中最常用的是同工酶标记，能较好地反映遗传多样性，在鱼类种质鉴定等领域得到广泛的应用。赵金良等[11]的研究发现，人工雌核发育团头鲂与选育群体在酯酶(EST)上存在的稳定差异，可作为该雌核发育群体与正常发育群体区分的生化遗传标志。Chen等[12]发现藏北高原色林错裸鲤(Cymnocyprisdistributed in the Selincuo Lake)、纳木错裸鲤(Cymnocyprisdistributed in the Namucuo Lake)和措鄂裸鲤(Cymnocyprisdistributed in the Cuoe Lake)的乳酸脱氢酶(LDH)、苹果酸脱氢酶(MDH)和EST 3个酶谱均表现出种间差异，且同一种群的个体间也存在明显的分化。对同工酶的认识是从LDH开始的，LDH也是一种研究相对深入的同工酶，在鱼类中多由ldh-a、ldh-b和ldh-c基因编码。ldh-c基因在鱼类中多具有组织特异性，在鲤形目鱼类中其多为肝脏组织所特有，电泳时多趋向阴极[13]。LDH能使细胞在供氧不足时仍能进行正常的生理活动，保证肌纤维在缺氧而机体仍需剧烈运动时，继续完成葡萄糖的无氧酵解过程，以提供ATP补充肌肉收缩所需能量[14]。MDH是一种催化苹果酸和草酰乙酸相互转变的酶，以细胞质型MDH(s-MDH)和线粒体型MDH(m-MDH)2种类型存在于动物组织中，s-MDH主要使细胞质中的草酰乙酸还原成苹果酸，再成为丙酮酸进入线粒体内开始新的氧化反应，m-MDH可以把苹果酸转化成草酰乙酸从而提供能量[15-16]。

目前有关翘嘴鲌的报道主要集中在养殖管理[17-18]、生理学特性[19-21]、营养学特性[22-24]、分子生物学[3,25-26]以及渔业资源状况[1-2,27]等方面，关于翘嘴鲌生化遗传特性方面也有一些报道[28-32]，但系统地报道翘嘴鲌各主要组织同工酶表达情况的文献较少。本研究通过形态学描述观察，测定可数、可量性状，并结合聚丙烯酰胺凝胶电泳(PAGE)技术检测不同组织中的LDH和MDH的分布情况，旨在从形态特征和生化遗传角度进一步丰富翘嘴鲌种质资源方面的研究内容，同时筛选出翘嘴鲌种质的特征生化遗传参数，为支撑其种质标准、探讨种质鉴定在翘嘴鲌资源保护和良种选育中的应用提供参考。

1 材料与方法

1.1 实验材料

实验用翘嘴鲌于2017年2月采自浙江湖州，共30尾，所有试验鱼均为池塘养殖所得，无伤、无畸形，体重为66.2～399.2 g，均值为(156.18±81.38)g，体长为18.8～33.5 cm，均值为(24.30±3.75)cm。

1.2 实验方法

1.2.1 形态测定

按照养殖鱼类性状测定的国标方法GB/T 18654.3—2008的规定，用游标卡尺(精确到0.01 mm)对30尾样本鱼进行测定。可数性状包括背鳍和臀鳍的鳍式、脊椎骨数、侧线鳞数、侧线上鳞数、侧线下鳞数以及左侧第一鳃弓外侧鳃耙数，共计7个参数。可量性状包括体长、体高、头长、吻长、眼径、眼间距、尾柄长和尾柄高，共计8个参数。

1.2.2 组织酶液的制备

组织酶液的制备方法参照张涛等[33-34]进行。首先在所测样本中选取5尾鱼，进行同工酶的普遍筛查，结合初步筛查结果确定某种组织的某种同工酶是单态，再从所测样本中随机抽取10尾健康翘嘴鲌对该种组织该同工酶进行验证，以初步确定翘嘴鲌种质的特征生化遗传参数。

于冰水中剪鳃放血后，迅速摘取心脏、眼晶状体、肌肉和肝脏4种组织，此过程在冰水浴下完成。各组织经预冷的生理盐水冲洗干净后，放入低温冰箱(-80 ℃)保存备用。

样品称重后放入入洗净预冷的匀浆器内，按质量体积比1∶3(g/mL)加入预冷双蒸水，冰浴条件下反复研磨至浆状，接着在4 ℃、12 000 r/min下离心3次，每次30 min，将上清液分装，-80 ℃保存以备电泳。

1.2.3 电泳方法

同工酶分析采用聚丙烯酰胺凝胶垂直板电泳，凝胶浓度、缓冲液的配制方法及电泳时间的确定参照孟彦等[35]的方法，并稍作改进，主要是将其连续胶改为不连续胶。分离胶浓度为7.5%，浓缩胶浓度为4%，凝胶缓冲液为pH 8.9的Tris-HCl，电极缓冲液为pH 8.3的Tris甘氨酸。电泳采用稳压方式，电压220 V，电泳时间为10 h。

1.2.4 染色方法

电泳结束后将凝胶板取下，室温避光染色，LDH染色方法参照余来宁等[36]的方法。待出现清晰条带后，将凝胶板用去离子水漂洗2～3次。将漂洗后的凝胶板平放在自制灯箱上，用尼康数码相机拍照。

1.2.5 模式图的绘制

采用Bandscan 5.0电泳图谱中的酶带进行灰度识别，并根据识别灰度绘制电泳图谱模式图。

1.3 数据处理

所得可量性状数据采用SPSS 20.0(IBM公司，美国)进行分析，结果以(平均值±标准差)表示。

2 结果与分析

2.1 形态描述及可数、可量性状

观测60尾翘嘴鲌(图1)，其体长而侧扁，腹部在腹鳍基至肛门间有腹棱，尾柄较长。头侧扁，头背平直。口上位，口裂几乎与体轴垂直，下颌厚，且向上翘起，突出于上颌之前，为头的最前端。眼大，位于头侧上方。鳃孔宽大，向前伸至眼后缘的下方；鳃盖膜连于峡部。背鳍位于腹鳍基部的后上方，末根不分支鳍条为粗大、光滑的硬刺，背鳍起点距吻端较距尾鳍基为近或相等。臀鳍起点至腹鳍基较至尾鳍基近。胸鳍较短，尖形，末端不达腹鳍起点。腹鳍位于背鳍前下方，其长短于胸鳍。尾鳍深叉形，末端尖形。体背部略呈青灰色，体侧呈银白色，各鳍呈灰黑色。

图1 翘嘴鲌外观形态Fig.1 Morphological measurement of Culter alburnus

鳔分三室，中室最大，后室细长而尖；下咽齿3行，齿式为2·4·4/5·4·2或2·4·4/5·3·2或1·4·4/5·4·2；腹膜为银白色。下咽齿末端成钩状。翘嘴鲌可数、可量性状分别见表1，表中给出了所测各指标的上下限，均值反映了所测数据的集中程度。可数性状中侧线鳞数变动范围最大，背鳍条数不变。可量性状中主要以体长和头长为参照，给出了吻长、眼径和眼间距等头部主要参数与头长的比例关系，也反映了体高、尾柄长和尾柄高等躯干部主要参数与体长的比例关系(详见表1中可量性状的比值)。

表1 翘嘴鲌的可数性状和可量性状的均值与标准偏差Tab.1 The mean values and standard deviation of countable and measurable parameters of Culter alburnus n=30

2.2 LDH的表达

翘嘴鲌的LDH同工酶表达结果如图2所示，在翘嘴鲌6种组织中共检测到8条LDH酶带，将靠近阳极最近的一条带定义为LDH1，自阳极向阴极方向依次编号为LDH2、3、4、5和6，不同组织中酶带数目和活性不同，呈现出明显的组织特异性。心脏组织中共检测到6条LDH酶带，其中LDH1和LDH2活性较强，LDH6活性最弱，LDH3和LDH4代表同一个位点的2个等位基因(图2A)；眼晶状体组织中共检测到6条LDH酶带，LDH在翘嘴鲌眼睛中的表达活性程度较其他5种组织弱，5尾样本鱼的LDH5和LDH6表达活性均较强，LDH3和LDH4代表同一个位点的2个等位基因(图2B)；肾脏组织中共检测到7条LDH酶带，3号鱼LDH1未检出，其余4尾样本鱼的酶带数和表达活性相同，LDH2、LDH3、LDH6和LDH7表达活性均较强，LDH1表达活性最弱，LDH4和LDH5代表同一个位点的2个等位基因(图2C)；脾脏组织中共检测到6条LDH酶带，5尾样本鱼LDH酶带数相同，LDH1表达活性最弱，LDH5和LDH6表达活性均较强，LDH3和LDH4代表同一个位点的2个等位基因(图2D)；肌肉组织中共检测到6条LDH酶带，LDH6表达活性最强，LDH1和LDH2表达活性均较弱，LDH3和LDH4代表同一个位点的2个等位基因(图2E)；肝脏中共检测到8条LDH酶带，LDH4、LDH5、LDH7和LDH8表达活性均较强，LDH1表达活性最弱，LDH4和LDH5代表同一个位点的2个等位基因。LDH8为已独立基因编码区，为ldh-c基因编码(图2F)。

图2 翘嘴鲌LDH电泳图谱A、B、C、D、E和F分别表示心脏、眼晶状体、肾脏、脾脏、肌肉和肝脏的LDH酶谱；1～5泳道分别表示不同个体的酶谱。Fig.2 Electrophoretogram of LDH isozymes in Culter alburnusA, B, C, D, E, F show electrophoretograms of LDH isozymes expressed in heart, eye, kidney, spleen, muscle and liver, respectively. 1-5 show the zymograms of different individuals.

2.3 MDH的表达

翘嘴鲌的MDH同工酶的表达如图3所示，在翘嘴鲌6种组织中共检测到6条MDH酶带，将靠近阳极最近的一条带定义为MDH1，自阳极向阴极方向依次编号为MDH2、3、4、5和6，不同组织中酶带数目和活性不同，呈现出明显的组织特异性。心脏组织中共检测到6条MDH酶带，其中MDH3活性较强(图3A)。眼晶状体组织中仅检测到1条MDH酶带(图3B)。肾脏组织中共检测到6条MDH酶带，其中MDH3表达活性最强，MDH5和MDH6两条酶带活性相对最弱(图3C)。和肾脏组织类似，脾脏组织中也检测到6条MDH酶带，其中MDH3表达活性较强，MDH5和MDH6两条酶带活性相对最弱(图3D)。肌肉组织中共检测到4条MDH酶带，其中MDH2表达活性较强，其余酶带表达活性相对较弱(图3E)。肝脏组织中共检测到4条MDH酶带，其中MDH3表达活性较强，其余酶带表达活性相对较弱(图3F)。

图3 翘嘴鲌MDH电泳图谱A、B、C、D、E和F分别表示心脏、眼晶状体、肾脏、脾脏、肌肉和肝脏的MDH酶谱；1～5泳道分别表示不同个体的酶谱。Fig.3 Electrophoretogram of MDH isozymes in Culter alburnusA, B, C, D, E, F show electrophoretograms of MDH isozymes expressed in heart, eye, kidney, spleen, muscle and liver, respectively; 1-5 show the zymograms of different individuals.

2.4 翘嘴鲌特征生化遗传参数

本研究中，5尾样本鱼肾脏组织LDH酶带均有多态现象，表现在不同样本鱼之间酶带数不同，心脏和脾脏中LDH酶带数以及各样本鱼表达活性程度都相同，但两者LDH均有拖带。虽然各样本鱼眼晶状体LDH酶带数以及表达活性程度都相同，但对于个体小的幼鱼制备同工酶样品较困难。肝脏成分复杂，离心后分层多，取上清液时易吸入表面脂肪层干扰后续染色过程。所有样本鱼肌肉组织LDH酶带数和表达活性程度相同，而且即使规格相对较小的样本鱼也能取到肌肉组织完成制样。各组织MDH酶带较为弥散，其分离效果也不及肌肉LDH，所以初步确定以肌肉组织LDH作为从生化遗传特征层面鉴定翘嘴鲌种质的备选对象。随机选择10尾样本鱼的肌肉组织，进一步电泳以验证肌肉组织LDH酶带表达情况，10尾样本鱼肌肉组织LDH同工酶图谱见图3，全部为单态，且表达稳定。鉴于此，本研究确定以肌肉组织LDH作为鉴定翘嘴鲌种质的特征生化遗传参数。

图4 翘嘴鲌肌肉组织LDH电泳图谱1～10泳道分别表示不同个体的酶谱。Fig.4 Electrophoretogram of LDH isozymes expressed in muscle of Culter alburnus1-10 show the zymograms of different individuals.

3 讨论

3.1 翘嘴鲌的形态学比较

本研究结果与文献中已报道翘嘴鲌的形态特征比较分析，发现有部分不同的地方。在可数性状方面的不同，见表2。造成可数性状差异的原因除了与样本量大小有关外，还可能与样本鱼的规格大小有关，如本研究中所测样本鱼均为成鱼，体长范围为27.3～33.5 cm；而《中国鲤科鱼类志》[37]和《太湖鱼类志》[38]所测样本鱼既有幼鱼，又有性成熟成鱼，体长范围分别为5.0～100.0 cm和4.5～27.8 cm。在可量性状方面，除头长/眼间距和体长/尾柄长外，其他诸如体长/体高、体长/头长等参数的变动范围，本研究所得结果与《中国鲤科鱼类志》[37]和《太湖鱼类志》[38]吻合；但本研究与《中国鲤科鱼类志》[37]关于体长/尾柄长的研究结果分别为5.59～6.78和5.3～6.3；至于头长/眼间距，本研究所得结果与《中国鲤科鱼类志》[37]和《太湖鱼类志》[38]分别为4.72～5.50、4.2～5.2和4.5～5.0。造成体长/尾柄长以及头长/眼间距与本研究间存在差异的原因除了与所测样本鱼的规格和样本量大小有关，还可能与测量方法有关。如《太湖鱼类志》[38]中标本41尾，测量6尾；本研究测量样本60尾。此外，本研究的测量方法遵照养殖鱼类性状测定的国标方法GB/T 18654.3—2008中的眼间距规定，即眼间距为左右两眼眶上缘的直线距离，而40多年前《中国鲤科鱼类志》[37]关于眼间距的测量起始点的界定并不清晰，不排除是由参数测量起始点不同而导致的结果差异。

表2 翘嘴鲌可数性状的比较Tab.2 Comparations of countable parameters of Culter alburnus

3.2 同工酶表达的组织特异性

本研究发现翘嘴鲌的各种组织中均能检测到LDH和MDH同工酶的表达，说明翘嘴鲌体内LDH和MDH同工酶分布比较广泛。从实验结果来看，LDH同工酶在翘嘴鲌组织中的表达具有组织特异性，即一种同工酶在同一个体的不同组织器官中表达的酶带数和表达活性不同。如LDH在翘嘴鲌心脏、肾脏和肝脏中分别检测到6、7和8条LDH酶带。肝脏是以代谢功能为主的器官，具有解毒、储存糖原、促进蛋白合成和分泌胆汁促消化等重要作用。相对其他几种组织而言，LDH在肝脏中的表达酶带数较多与肝脏执行重要生理功能是相辅相成的。MDH同工酶在翘嘴鲌各组织中的表达也呈现出组织特异性，MDH在不同组织中表达的酶带数和活性强度不同，心脏、肾脏和脾脏中表达的酶带数比其他3种组织多，肾脏中酶带的活性强度比眼晶状体中强。

同工酶在组织器官中的表达情况受遗传基因调控，因此部分酶基因只在特定的组织或器官中表达。一般认为，脊椎动物同工酶LDH在胚胎发育和细胞分化中具有明显的分化调控模式，表现出高度的发育和组织特异性[16]。在脊椎动物中，LDH是由A、B和C 3个基因位点编码的四聚体蛋白质，A、B基因在脊椎动物各组织器官中普遍表达，而C基因的表达具有高度组织特异性，这种特异性随物种(特别是类群)不同而有明显差别[40]。已有研究表明，ldh-c基因在鱼类中多具有组织特异性，鲤形目鱼类中ldh-c多为肝脏组织所特有，电泳时多趋向阴极[13]。本研究中，翘嘴鲌肝脏组织中向阴极迁移的LDH8酶带，在其他组织中未见表达，与蒋晓华等[13]在研究滇池高背鲫时发现的现象类似，初步判定为c带。

3.3 翘嘴鲌LDH和MDH同工酶的比较及同工酶分析在良种选育中的应用

将翘嘴鲌LDH和MDH同工酶的文献[28-32]与本研究比较，结果见表3。本研究与已有文献的研究结果比较有如下异同点： 1) 除吴兴兵等[29]仅以肌肉为研究对象外，本研究与其余4位研究者都仅在肝脏中发现了c基因的表达。2)除杨玲等[31]在黄河翘嘴鲌野生群体心脏中发现8条LDH酶带外，本研究中心脏、肌肉和眼睛的LDH酶带数均比马波等[28]、戈志强等[32](没研究肌肉和肝脏)、朱华平等[30]及杨玲等[31](心脏除外)的研究结果多1条带。分析其原因，本研究认为心脏、肌肉和眼睛3种组织的第3和第4条LDH酶带代表同一位点的2个等位基因，带型上可划为2条酶带，与之前研究结果相符[39]；至于杨玲等[31]在黄河翘嘴鲌野生群体中发现心脏中共有8条LDH酶带，野生群体心脏LDH酶带数比养殖群体多的原因，尚待进一步研究。3)除眼睛外，本研究中，心脏、肾脏、肌肉和肝脏MDH酶带数与朱华平等[30]的研究结果一致。关于本研究与朱华平等[30]眼睛中MDH酶带数的差异是否由于不同地理种群造成的，尚有待进一步考证。此外，本研究与已报道的研究结果之间的差异，还可能与实验方法有关。如本研究肌肉MDH酶带数与马波等[28]的差异，可能是由于两者分别采用淀粉凝胶水平电泳和聚丙烯酰胺凝胶电泳所致；不同凝胶浓度也可能会造成差异，因不同浓度的凝胶内部结构空隙大小不同，使得电泳过程中对酶带的分离效果不同。

同工酶种类较多，除了本研究中涉及的LDH和MDH，常见的还有酯酶(EST)、醇脱氢酶(ADH)和超氧化物歧化酶(SOD)等，其中LDH是研究最早也是研究最深入的同工酶之一，LDH和MDH在机体生理功能中扮演重要的角色，不少鱼类种质生化遗传特性研究中均以LDH或MDH作为重要的参考指标[39,43-45]，不同组织的LDH或MDH表现出明显的差异性。鉴于此，本研究选择LDH和MDH作为研究翘嘴鲌生化遗传特性的参考指标，并经实验确定，肌肉组织LDH酶带数和表达活性稳定且相同，确定为鉴定翘嘴鲌种质的特征遗传参数。

表3 翘嘴鲌LDH和MDH研究结果比较Tab.3 Comparations of research results about LDH and MDH isozymes expressed in Culter alburnus

注：“—”表示无。

另由于天然水域中鲌属鱼类种间能进行杂交产生可育后代[46]，通过对翘嘴鲌同工酶的研究能有效鉴定出杂交后代并与父母本的亲缘关系作比较，也为翘嘴鲌的良种选育提供理论依据，这一技术已应用在不少鱼类良种选育过程中[47-49]。

4 结论

本研究采用传统形态学方法观测了翘嘴鲌的形态特征，其侧线鳞、臀鳍条和鳃耙数目分别为75～89、20～24和23～26，部分可数、可量性状与已报道文献[37-38]存在差异,可能是由于样本数量、规格以及测量方法不同所致。同时，通过PAGE电泳较为系统地对翘嘴鲌6种主要组织的LDH和MDH同工酶进行分析，初步确定了肌肉组织中LDH表达量高且活性稳定，可作为鉴定翘嘴鲌种质的特征生化遗传参数。对翘嘴鲌同工酶的分析，有利于从生化遗传层面比较翘嘴鲌与其他鲌属鱼类的亲缘关系，同时可为其种质标准的建立及良种选育提供参考依据。