超高效液相色谱-串联质谱法测定罗非鱼血浆和肌肉中的丁香酚残留

林丽聪

(福建省淡水水产研究所，福州 350002)

丁香酚，分子式为C10H12O2，化学名为2-甲氧-4-丙烯基酚，是一种香料，对鱼有强烈的麻醉作用，因其价廉易得，且能够快速从血液和组织中排出等优点[1]，日本、新西兰和澳大利亚等国将丁香酚列为安全可靠的渔用麻醉剂[2-3]，但其安全性仍存在一定争议。据欧洲食品安全局(EFSA)报告称，丁香酚具有肝毒性，可能会造成肝脏损伤[4]；美国国家毒理学计划(NTP)认为丁香酚属于可疑致癌物质[5]，因此，美国和加拿大迄今为止未批准丁香酚类化合物为合法的渔用麻醉剂[6-7]。日本虽允许丁香酚作为渔用麻醉剂使用，但规定其最高残留限量(MRL)为0.05 mg/kg[8]。中国相关部门至今并没有批准丁香酚类渔用麻醉剂应用于水产品，但据相关调研表明，鲜活水产品流通环节常用丁香酚作为麻醉剂[9]。

罗非鱼(Oreochromismossambicus)属热带鱼类，因具有生长快、食性广、繁殖力强、群体产量高、对环境适应力强、抗病力强和肉质细腻鲜美等特点，是联合国粮农组织(FAO)向全世界推荐养殖的水产优良品种，养殖区域已遍布85个国家和地区，成为国际上养殖最广泛的鱼类之一。受气候与地理条件的影响，中国罗非鱼养殖呈现明显南多北少的现象。南方地区的广东省、广西壮族自治区、海南省、福建省及云南省得益于气候条件，罗非鱼养殖发展迅速，占据了全国产量的绝大部分。罗非鱼大部分以鲜活运输的方式销往四川、新疆、北京及上海等地。对于商家来讲，越是鲜活、质量好的水产品越能获得更高的利润，但在水产品的长途运输过程中，生物易产生应激反应，而应激反应会引起水产品肉质的损伤，甚至导致死亡，死亡后的水产品从价值到口感都大打折扣。麻醉剂因具有镇静作用而被应用于水产品的保活运输中。2013年，北京市某水产市场使用丁香油水门汀(含丁香酚)运输活鱼，经媒体曝光后引起广泛关注[10]。由于缺乏丁香酚毒理学、药理学及其药物代谢动力学方面的研究，丁香酚是否可用和具体用量，其作为食物被麻醉后对人体产生的具体影响，已成为消费者关注的话题[11]。因此，急需开展丁香酚在罗非鱼中的残留检测技术研究以及深入的药物代谢动力学研究。

目前，关于鱼、虾、蟹和水体中丁香酚类化合物的检测方法主要有高效液相色谱法[12-16]、气相色谱法[17]、液相色谱-串联质谱法[9,18-20]、气相色谱-串联质谱法[3,21-25]等。其中，高效液相色谱法和气相色谱法在测定复杂基质样品时，容易受干扰，且属常量分析，检测限高[12-17]。而色谱-串联质谱联用技术具有较高特异性，能较好地解决复杂基质样品杂质干扰的问题，但采用气相色谱-串联质谱法，丁香酚会在96 h后降解[23]。现有研究多是集中在水产品肌肉中丁香酚残留量的研究，其方法大多操作复杂、检测耗时长，而对血浆中丁香酚的残留检测研究较少。且国内外暂未见采用UPLC-MS/MS对罗非鱼血浆中丁香酚残留检测的研究。因此，本研究探讨应用UPLC-MS/MS检测罗非鱼血浆中丁香酚的残留；同时进一步优化罗非鱼肌肉中的丁香酚残留检测方法，旨在为完善水产品中丁香酚残留检测方法提供支持，也可为相关标准方法的制订提供参考依据，保障罗非鱼的食品安全。

1 材料和方法

1.1 仪器与试剂

主要仪器包括：超高效液相色谱-串联质谱联用仪(WatersTQ-XS)；Waters UPLC BEH C18色谱柱(50.0 mm×2.1 mm，1.7 μm)；HLB固相萃取柱(Waters Oasis 6CC，200 mg)；滤膜(有机相尼龙0.22 μm微孔滤膜)以及超纯水机(美国Millipore公司)；离心机(美国Sigma公司)；旋涡振荡器(德国IKA公司)；电子天平(德国Sartorius公司)等。

主要试剂包括：丁香酚标准品(外标物，纯度≥98%，北京百灵威科技有限公司)；丁香酚-D3标准品(内标物，纯度≥98%，美国Accustandard公司)；甲醇、乙腈均为色谱纯(美国Fisher公司)，正己烷为分析纯(国药集团化学试剂公司)。

1.2 实验方法

1.2.1 标准溶液的配制

准确称取10.0 mg丁香酚标准品，置于100 mL容量瓶中，用甲醇溶解并定容，配成100.0 μg/mL的贮备液；经甲醇稀释，配制成质量浓度为100 μg/L的标准中间液，存于-20 ℃冰箱(保存3个月内稳定)。使用时用甲醇配制成不同浓度的标准工作液。

准确称取2.0 mg丁香酚-D3(内标物)，用甲醇溶解并定容至10 mL，配制成0.2 mg/mL的内标贮备液，存于-20 ℃冰箱。使用时用甲醇稀释成20 μg/L的标准工作液。

1.2.2 血浆前处理

用移液器准确移取400 μL血浆样品，加入800 μL甲醇，涡旋混匀5 min，于13 000 r/min离心10 min，上清液过0.22 μm滤膜，进样。

1.2.3 肌肉前处理[9]

将样本打成匀浆，称取2.00 g均质样品于50 mL离心管中，加入20 μg/L丁香酚-D3内标物20 μL，加入5 mL正己烷，旋涡振荡5 min后超声10 min，以9 000 r/min离心5 min，转移上清液，残渣用5 mL正己烷按上述步骤重复提取1次，合并2次提取液，置于40 ℃水浴中，氮吹至近干，用3 mL 40%甲醇溶液复溶，9 000 r/min离心5 min，待上样。

用4 mL甲醇和4 mL水，活化HLB固相萃取柱，上样，用3 mL 40%甲醇溶液淋洗之后用4 mL甲醇洗脱，洗脱液过0.22 μm滤膜，上机。

1.2.4 液相色谱条件

采用Waters UPLC BEH C18色谱柱；进样量5 μL；柱温40 ℃，流速0.3 mL/min。流动相A为0.1%氨水，流动相B为乙腈，采用梯度洗脱，梯度洗脱程序为：0～0.5 min，25%B；0.5～2.5 min，25%B～95%B；2.5～3 min，95%B；3～4.5 min，95%B～25%B；4.5～5 min，25%B。

1.2.5 质谱条件

离子源为电喷雾离子源，负离子模式(ESI-)；多重反应监测模式(MRM)；毛细管电压1.48 kV，锥孔电压29 V，脱溶剂气温度500 ℃，脱溶剂气流量1 000 L/h，碰撞气流速0.15 mL/min。多反应监测离子对及条件见表1。

1.2.6 标准曲线的绘制

取6份空白样品(血浆或肌肉)分别加入相应体积的标准溶液，配制成丁香酚含量分别为1.0、3.0、5.0、10.0、50.0和100.0 μg/L的血浆样品和1.0、3.0、5.0、10.0、50.0和90.0 μg/kg的肌肉样品，分别按1.2.2及1.2.3方法对样品处理后，计算血浆和肌肉的标准工作曲线回归方程和相关系数。

1.2.7 检出限与定量限确定

取空白血浆添加丁香酚标准溶液，按1.2.2方法处理；取空白肌肉添加丁香酚标准溶液和内标溶液，按1.2.3方法处理，每个浓度做6组平行试验。

1.2.8 方法回收率与精密度测定

取空白血浆进行3个水平的添加，丁香酚的添加水平分别为2.0、4.0和20.0 μg/L，每个水平做6个平行样品，按1.2.2方法处理；取空白肌肉进行3个水平的添加，丁香酚的添加水平分别为2.0、4.0和20.0 μg/kg，每个水平做6个平行样品，按1.2.3方法处理，计算回收率和精密度。

表1 丁香酚的质谱多反应监测离子对及质谱条件参数Tab.1 MRM ion pairs and mass spectral parameters for eugenol

注：其中“*”为定量离子。

2 结果与分析

2.1 实验条件的优化

2.1.1 内标法和外标法的选择

在实验前期，参考相关文献[15-16]，罗非鱼血浆和肌肉的丁香酚含量均采用外标法来测定。预实验发现，血浆前处理步骤简单，只需提取和离心过滤，采用外标法加标试验，丁香酚回收率即可大于97%，满足检测要求；而肌肉的前处理，由于需要过HLB固相萃取柱，会有部分丁香酚被淋洗，采用外标法加标试验，其回收率只有70%左右。为了使实验数据更加准确，参考相关内标法文献[9,22]，本实验重新建立了内标法，进行肌肉中丁香酚回收率实验，发现回收率大于90%，满足检测要求。因此，本研究中确定分别以外标法和内标法测定罗非鱼血浆和肌肉中的丁香酚残留。

2.1.2 淋洗液浓度的优化

在不加内标的情况下，分别比较了不同体积比的甲醇溶液淋洗效果(图1)，结果显示，当甲醇体积比低于40%时，不能有效淋洗基质，回收率较低；当甲醇体积比高于40%，可以有效去除丁香酚干扰基质，但同时随着甲醇体积比的提高，丁香酚被洗脱的可能性也提高。因此，为了保证洗脱基质，同时保证丁香酚不被洗脱，本实验选用40%甲醇溶液作为淋洗液。

图1 不同体积比甲醇对回收率的影响(n=3)不同字母(a-c)之间差异显著(P>0.05)。下同。Fig.1 Effects of different volume proportion of methanol on recovery rates(n=3)Significant difference in different letters(a-c，P<0.05).The same below.

2.1.3 洗脱液体积的优化

取HLB固相萃取柱，活化后，添加50 μg/L的丁香酚标准溶液，经过淋洗后，用甲醇洗脱，每添加1 mL洗脱液收集一次，比较不同洗脱体积的回收率。结果显示，1 mL的甲醇洗脱液可以洗脱出78%左右的丁香酚，在第4次1 mL洗脱时，丁香酚回收率达峰值，再次添加淋洗液回收率无显著差异(P>0.05)。因此，确定使用洗脱液体积为4 mL(图2)。

图2 洗脱体积对回收率的影响(n=3)Fig.2 Effects of different elution volume on recovery rates(n=3)

2.1.4 色谱条件的优化

为了使丁香酚色谱条件达到最佳，分别选取了BEH C18色谱柱(1.7 μm，2.1 mm×50.0 mm)和HSS T3色谱柱(1.8 μm，2.1 mm×50.0 mm)进行实验，结果显示，HSS T3色谱柱峰形较差，峰较宽且为明显的前沿峰；BEH C18色谱峰形尖锐，无拖尾，并和杂质峰有较好的分离。采用梯度洗脱程序，进一步考察对比了甲醇水、乙腈水、甲醇-0.1%氨水和乙腈-0.1%氨水4种不同流动相的分离情况。结果表明，甲醇水和乙腈水作为流动相时，丁香酚峰型差，灵敏度较低。而甲醇-0.1%氨水和乙腈-0.1%氨水作为流动相时，由于氨水的存在使丁香酚更易失去氢离子(H+)，离子化效率提高，灵敏度高。且相比之下，乙腈-0.1%氨水的灵敏度最高，和杂质分离效果最好，峰型最好。故本研究确定以乙腈-0.1%氨水作为流动相。

2.2 方法的线性、检出限和定量限

在1.0～100.0 μg/L线性范围内，丁香酚在罗非鱼血浆中的线性方程及相关系数为Y=1 467X-272(r=0.998 5)；以3倍信噪比(S/N=3)计算得该方法检出限为0.60 μg/L，以10倍信噪比(S/N=10)计算得该方法的定量限为2.0 μg/L。在1.0～90.0 μg/kg线性范围内，丁香酚在罗非鱼肌肉中的线性方程及相关系数为Y=0.015 4X-0.002 5(r=0.999 8)；以S/N=3计算得该方法检出限为0.65 μg/kg，以S/N=10计算得该方法的定量限为2.0 μg/kg。

2.3 方法的回收率和精密度

罗非鱼血浆3个添加水平(2.0、4.0和20.0 μg/L)的平均回收率为97.0%～98.9%，相对标准偏差为1.14%～2.21%；肌肉3个添加水平(2.0、4.0和20.0 μg/kg)的平均回收率为90.2%～95.9%，相对标准偏差为1.91%～5.28%(表2)。

表2 罗非鱼血浆和肌肉中丁香酚的回收率及精密度Tab.2 Recoveries and precision of the eugenol in muscle and plasma of tilapia n=6

3 讨论

关于罗非鱼血浆中丁香酚残留的检测，目前见报道的多为高效液相色谱法[16]测定，暂未见采用UPLC-MS/MS的检测方法。孙宇航等[16]经乙酸乙酯、氨水和无水硫酸钠提取，采用正己烷净化的方法，建立了罗非鱼血浆中丁香酚残留检测的高效液相色谱法，其方法检出限为5.0 μg/kg。本研究建立了UPLC-MS/MS检测罗非鱼血浆中丁香酚残留的方法，采用甲醇提取，高速离心后即可直接上机检测，与HPLC法相比，其前处理方法简单，灵敏度、准确度均较高。

目前已有学者采用UPLC-MS/MS测定水产品肌肉中丁香酚残留的研究，如赵东豪等[9]采用正己烷提取，经UPLC-MS/MS测定，内标法定量的方法对鱼类肌肉中丁香酚的残留进行检测，定量限为2.5 μg/kg。孙鹏等[18]针对河蟹、对虾和鲤建立了漂浮固化分散液-液微萃取结合UPLC-MS/MS的方法测定丁香酚，定量限为4.91 μg/kg。倪峥飞等[19]建立了固相萃取-超高效液相色谱-串联质谱(UPLC-MS/MS)分析法，测定鲫、对虾中4种丁香酚类麻醉剂残留量，以外标法定量，结果表明，丁香酚定量限为2.5 μg/kg。而目前未见采用UPLC-MS/MS测定罗非鱼肌肉中丁香酚残留的研究报道。

在罗非鱼肌肉中丁香酚的检测研究方面，陈焕等[12,17,21]采用高效液相色谱法测定了罗非鱼、南美白对虾及鳗鲡中丁香酚类麻醉剂的残留量，其定量限为50 μg/kg；采用GC-MS法同时测定罗非鱼、南美白对虾及扇贝中6中丁香酚类麻醉剂的残留量，方法的定量限为1.0 μg/kg；采用分散固相萃取-气相色谱法同时测定罗非鱼、南美白对虾、鳗鲡以及梭子蟹肌肉中6种丁香酚类麻醉剂的残留量，方法的定量限为100 μg/kg。高平等[13]采用固相萃取-高效液相色谱-荧光检测法测定了包括罗非鱼在内的水产品中4种丁香酚类化合物，方法检出限为3.0～6.0 μg/kg。黄武等[14]采用乙腈为提取溶剂，经超声提取、正己烷脱脂净化2次后，通过高效液相色谱技术检测，外标法定量，建立了罗非鱼中丁香酚残留量的高效液相色谱分析方法，其的检出限为0.03 mg/kg。孙宇航等[16]建立了罗非鱼肌肉中丁香酚残留检测的高效液相色谱法，其方法检出限为 5.0 μg/kg。

本研究中罗非鱼肌肉中丁香酚残留检测方法与赵东豪等[9]的方法相似，均采用电喷雾离子源(ESI)负离子扫描，多反应监测模式(MRM)测定，且均是以子离子m/z163>148作为定量离子，以m/z163>121作为第一定性离子，以m/z166>148作为丁香酚-D3内标离子峰。与赵东豪等[9]方法的不同之处在于样品处理方法：本研究中，在采用正己烷提取的基础上，增加了HLB固相萃取柱净化过程，更有效地将分析物与干扰组分分离；且在上HLB柱之前，再次离心样品，防止出现堵塞现象，提高了分析物的回收率；流动相改用乙腈-0.1%氨水，氨水使丁香酚更易失去H+，可提高样品离子化效率及灵敏度。结果表明，本研究所建立的罗非鱼肌肉丁香酚UPLC-MS/MS方法定量限可达2.0 μg/kg，较此前研究灵敏度略有提高。

本研究同时开展罗非鱼血浆和肌肉中丁香酚残留的研究，其中血浆前处理方法简单，肌肉前处理较为繁琐，在日常的监督检测中，建议取血浆抽检，更加方便快捷，大大提高检测效率。

4 结论

本研究建立了一种使用超高效液相色谱-串联质谱联用仪检测罗非鱼血浆和肌肉中丁香酚残留的方法，血浆和肌肉中丁香酚的定量限分别为2.0 μg/L和2.0 μg/kg。实验结果表明，该方法具有灵敏度高、准确度好的特点，能够满足罗非鱼血浆和肌肉中丁香酚的检测要求，可为相关标准方法的制订提供参考依据，为丁香酚在罗非鱼体内的药代动力学研究提供技术支持，为丰富和完善丁香酚在罗非鱼体内的使用方法和休药期的制订提供基础数据，同时为其他鱼类血浆中丁香酚残留检测提供方法参考。