汽化吸入PFC对肺损伤猪肾上皮细胞凋亡的影响

秦鑫　秦蕾　刘又宁

【摘要】 目的 通過对肺灌洗造成小猪肺损伤模型行全氟化碳（PFC）汽化吸入， 了解其对肺损伤小猪肾小管上皮细胞凋亡的影响。方法 取健康小猪20只， 随机分为VMV组（PFC汽化吸入， 10只）、CMV组（常规机械通气， 8只）和假手术组（2只）。取各组肾皮髓交界处肾脏组织， 采用电镜观察凋亡细胞超微结构， DNA断裂的原位末端标记法（TUNEL）法检测细胞凋亡指数， 免疫组织化学法测定凋亡基因B细胞淋巴瘤/白血病-2（bcl-2）、bcl-2相关X蛋白（BAX）蛋白的表达， 半定量逆转录-聚合酶链反应（RT-PCR）法测定BAX、bcl-2核糖核酸（mRNA）表达。结果 TUNEL结果：肾的阳性细胞主要分布在近端肾小管， 肾小球未见凋亡细胞。VMV组细胞凋亡率为（20.2±2.9）%， 明显低于CMV组的（80.2±4.8）%， 差异有统计学意义（t=32.868， P=0.000<0.05）。肾BAX、bcl-2蛋白表达结果：VMV组的肾BAX蛋白表达（12.6±6.8）明显低于CMV组的（62.2±3.6）， bcl-2蛋白表达（36.8±2.1）明显高于CMV组的（6.2±2.3）， 差异均有统计学意义（P<0.05）。肾BAX、bcl-2 mRNA表达结果：VMV组的肾BAX mRNA表达（7.10±0.32）明显低于CMV组的（9.29±1.06）， bcl-2 mRNA表达（10.29±2.51）， 明显高于CMV组的（5.18±1.08）， 差异均有统计学意义（t=6.230、5.350， P<0.05）。假手术组细胞凋亡数极少， BAX、bcl-2表达均很低。结论 汽化吸入PFC可减少急性肺损伤小猪肾小管上皮细胞凋亡， 其作用机制可能与抑制BAX基因的蛋白表达及升高bcl-2基因表达有关。

【关键词】 全氟化碳;急性肺损伤;凋亡;机械通气;肾脏

DOI：10.14163/j.cnki.11-5547/r.2019.17.108

Effect of vaporization inhalation of PFC on apoptosis of renal tubular epithelial cells in pigs with lung injury   QIN Xin， QIN Lei， LIU You-ning. Department of Respiratory Medicine， Second Hospital of Shanxi Medical University， Taiyuan 030001， China

【Abstract】 Objective   To understand the effect of vaporization inhalation of perfluorocarbon （PFC） for model of pig lung injury caused by lung lavage on apoptosis of renal tubular epithelial cells in lung injury. Methods   A total of 20 healthy pigs were randomly divided into VMV group （vaporization inhalation of PFC，

10 pigs）， CMV group （conventional mechanical ventilation， 8 pigs） and sham operation group （2 pigs）. Kidney tissue at the junction of renal cortex and medulla was taken from each group. Ultrastructure of apoptotic cells was observed by electron microscopy， apoptotic index was detected by terminal-deoxynucleoitidyl transferase mediated nick end labeling（TUNEL）， expression of apoptotic genes B cell lymphoma/leukemia-2 （bcl-2） and bcl-2 related X protein （BAX） was determined by immunohistochemistry， and expression of BAX and Bcl-2 ribonucleic acid （mRNA） was determined by Semi-quantitative reverse transcription-polymerase chain reaction （RT-PCR）. Results   TUNEL results： The positive cells of the kidney were mainly distributed in the proximal tubules， and no apoptotic cells were found in the glomeruli. VMV group had obviously lower apoptosis rate as （20.2±2.9）% than （80.2±4.8）% in CMV group， and the difference was statistically significant （t=32.868， P=0.000<0.05）. Renal BAX， bcl-2 protein expression results： VMV group had obviously lower BAX protein expression as （12.6±6.8） than （62.2±3.6） in CMV group， and obviously higher bcl-2 protein expression as （36.8±2.1） than （6.2±2.3） in CMV group. Their difference was statistically significant （P<0.05）. Renal BAX and bcl-2 mRNA expression results：VMV group had obviously lower BAX mRNA expression as （7.10±0.32） than （9.29±1.06） in CMV group， and obviously higher bcl-2 mRNA expression as （10.29±2.51） than （5.18±1.08） in CMV group. Their difference was statistically significant （t=6.230， 5.350， P<0.05）. The apoptotic cells in sham operation group were very few and the expressions of BAX and Bcl-2 were very low. Conclusion   Vaporized inhalation of PFC can reduce the apoptosis of renal tubular epithelial cells in piglets with acute lung injury. Its mechanism may be related to inhibiting the expression of BAX gene and increasing the expression of Bcl-2 gene.

【Key words】 Perfluorocarbon; Acute lung injury; Apoptosis; Mechanical ventilation; Kidney

急性肾功能衰竭在急性肺损伤所致多器官功能障碍综合征（MODS）中占据着重要地位， 其使MODS患者的死亡率达到88%。肾细胞凋亡是急性肾功能衰竭的早期表现。本研究通过对行机械通气肺损伤小猪汽化吸入PFC治疗， 以了解机械通气肺损伤后肾小管上皮细胞凋亡及PFC汽化吸入对肾小管上皮细胞的保护。现报告如下。

1 材料与方法

1. 1 材料来源 选取健康小猪20只（购于山西医科大学实验动物中心）， 平均体重（4.5±0.5）kg， 随机分为3组：①VMV组10只， 机械通气[容量控制， 潮气量（Vt）：8 ml;呼吸频率（f）：30次/min;吸入氧浓度（FiO2）=50%;吸呼比（I∶E）=1∶1]， 应用湿化罐装置加热蒸发， 经呼吸机管路给予PFC汽化吸入2 h， 并于治疗后机械通气6 h;② CMV组8只， 给予常规机械通气（参数同前）8 h;③假手术组2只， 只打开腹腔， 取出肾脏， 作为正常对照。

1. 2 实验方法

1. 2. 1 模型制备 应用盐酸氛氨酮25 mg和盐酸二甲苯胺噻嗪（商品名：麻保静注射液）4 mg混合后对小猪行基础麻醉， 戊巴比妥钠（20 mg/kg）行静脉全身麻醉（全麻）。气管切开插管连接呼吸机。行颈总动脉和颈总静脉插管， 采用多功能监护仪压力传感器监测动脉血压， 采集动脉血气标本并取血。颈总静脉插管连接三通桥， 测定中心静脉压， 连接林格液及注射药物。动物模型应用十六烷磺基丁二酸钠盐按照

2 mg/kg的剂量、1∶1比例配制生理盐水和无水乙醇溶解后气管内注入， 然后反复改变猪体位使药物能够均匀地分布在肺内各叶， 以此制作急性肺损伤动物模型。

1. 2. 2 汽化治疗方法 VMV组动物急性肺损伤模型制作成功开始治疗时， 迅速用装有等量PFC的同型号湿化罐替换连接于呼吸机管路中的湿化罐， 同时将湿化加热温度调至3档（PFC液体温度47～49℃， 呼吸机管路Y型口处温度37～38℃）， 即可开始汽化吸入治疗。两组动物均于6 h机械通气过程中， 监测动脉血气、血液动力学、呼吸力学指标， 汽化吸入治疗2、8 h时抽动脉血3 ml， 离心取血浆。6 h常规机械通气结束后， 处死实验动物， 打开腹腔， 取出皮髓交界处肾脏数小块， 分别置于10%福尔马林和液氮冻存管保存。

1. 2. 3 检测方法 取各组肾皮髓交界处肾脏组织， 采用电镜观察凋亡细胞超微结构， TUNEL法检测细胞凋亡指数， 免疫组织化学法测定凋亡基因BAX、bcl-2蛋白的表达， RT-PCR法测定BAX、bcl-2 mRNA表达。

1. 3 统计学方法 采用SPSS13.0统计学软件对数据进行统计分析。计量资料以均数±标准差（ x-±s）表示， 采用t检验。P<0.05表示差异具有统计学意义。

2 结果

2. 1 TUNEL结果 肾的阳性细胞主要分布在近端肾小管， 肾小球未见凋亡细胞。CMV组见肾小管上皮细胞凋亡， 核染色质浓缩、边聚呈环状， 或核固缩、碎裂呈不规则球块， 细胞质高度肿胀， 或溶解， 或致密度增加， 周围淋巴细胞浸润。VMV组肾小管上皮细胞的凋亡减轻， 凋亡率明显降低。VMV组细胞凋亡率为（20.2±2.9）%， 明显低于CMV组的（80.2±4.8）%， 差异有统计学意义（t=32.868， P=0.000<0.05）。

2. 2 肾BAX、bcl-2蛋白表达结果 VMV组的肾BAX蛋白表达（36.8±2.1）明显低于CMV组的（62.2±3.6）， bcl-2蛋白表达（12.6±6.8）明显高于CMV组的（6.2±2.3）， 差异均有统计学意义（P<0.05）。

2. 3 肾BAX、bcl-2 mRNA表达结果 VMV组的肾BAX mRNA表达（7.10±0.32）明显低于CMV组的（9.29±1.06）， bcl-2 mRNA表达（10.29±2.51）明显高于CMV组的（5.18±1.08）， 差异均有统计学意义（t=6.230、5.350， P<0.05）。

2. 4 假手术组情况 假手术组凋亡细胞极少， BAX、bcl-2表达均很低， 只作为对照参考。

3 讨论

MODS是急性肺損伤或急性呼吸窘迫综合征（ARDS）的主要死亡原因， 死亡率高达60%～98%[1]。而目前治疗ARDS的基本方法是机械通气， 由于机械通气是正压通气， 与人体的负压通气不同， 因此其本身在治疗肺损伤的同时亦可加重肺损伤[2]。有研究表明， 保护性通气的策略可减少MODS， 降低ARDS的死亡率[3]。然而， 经机械通气治疗的ARDS患者发生MODS的机制及保护性通气策略如何降低其死亡率尚不清楚。

肾脏是MODS中最早出现损伤的脏器之一， 一旦发生肾功能衰竭， MODS的死亡率将大大增加。肾小管上皮细胞的凋亡是肾功能失调的早期表现[4]， 对肾功能衰竭早期诊断提供预警指标， 并对判断预后提供依据。肾小管上皮细胞的凋亡可造成小管液回漏、基底膜裸露、转运功能丧失等功能障碍， 成为少尿、无尿等病理生理改变的基础， 在肾功能的损害过程中发挥着无法估量的作用[5]。本研究结果也发现， 肺损伤的小猪模型经机械通气干预后， 肾小管上皮细胞发生凋亡， CMV组较假手术组凋亡率有明显增加趋势。

PFC是碳氢化合物中氢原子被氟原子取代后形成的一类化合物， 医学上常用的PFC碳原子为6～12个， 常温下是无色、无味、无毒的透明液体， 密度高， 表面张力低， 化学性质稳定， 在体内不发生代谢， 粘度高于水而低于血液， 不溶于水、血液、脂类及其他介质。PFC有良好的气体运载能力， 对氧的溶解释放在10 ms内完成， 且过程可逆， 比人血红蛋白所需的30 ms快得多， 其对二氧化碳的溶解释放时间更短， 仅为4 ms， 且过程可逆。因此PFC作为机械通气时运送氧和二氧化碳的载体， 衍生出PFC雾化、PFC汽化通气、部分及全液体通气等机械通气方式[6]。有研究证明， 汽化通气改善肺功能方面亦有显著效果[7]。研究发现， 经机械通气后， 肾小管上皮细胞凋亡程度明显增加， 故推断机械通气的ARDS患者发生MODS， 可能与肾小管上皮细胞凋亡增加有关， 而经汽化通气后， 肾小管上皮细胞凋亡程度降低， 也证实了这一推断。PFC通过以下途径降低肾小管上皮细胞的凋亡：①通过改善肺的呼吸功能， 增加血氧饱和度， 纠正肾小管上皮细胞缺氧。因为急性肺损伤时， 缺氧使肾脏致密斑细胞肥大， 并合成、分泌肾素， 肾素-血管紧张素-醛固酮系统激活来抑制致密斑细胞， 促使其凋亡[8];②通过改善肺通气/血流， 减轻肺毛细血管损伤， 减少血管紧张素转换酶释放， 进而通过调节肾素-血管紧张素轴影响肾血管的血流;③通过提高动脉血氧分压， 因为急性肺损伤时血液中氧含量低， 肾皮质髓质血流重新分布， 髓质血流减少， 血管紧张素Ⅱ在髓质中的密度是皮质的4～5倍， 促使髓质细胞凋亡;④稳定细胞膜及抑制呼吸道炎性因子、细菌内毒素的产生释放入血， 抑制细菌生长繁殖， 引起肾小管上皮细胞的损伤;⑤影响凋亡调节基因表达， 从而影响肾小管上皮细胞凋亡。

綜上所述， 机械通气肺损伤小猪肾小管上皮细胞凋亡增高， 存在BAX过表达;经PFC汽化吸入后的BAX表达降低， 抗凋亡因子bcl-2表达增加， 亦说明BAX、bcl-2在其整个凋亡调节过程中起着不可估量的作用。

参考文献

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[收稿日期：2018-11-23]