3种沙眼衣原体POCT检测试剂盒性能评估*

赵 颖，王 瑶，徐英春，倪安平△

(1.中国医学科学院北京协和医院检验科，北京 100730；2.侵袭性真菌病机制研究与精准诊断北京市重点实验室，北京 100730)

沙眼衣原体生殖道感染是最常见传播疾病之一，大多数无症状感染，但若不及时治疗，沙眼衣原体可引起女性输卵管瘢痕化，并可导致女性异位妊娠和输卵管因素不孕、盆腔炎、慢性盆腔疼痛,可引起男性尿道炎、附睾炎、直肠炎,并且衣原体感染会增加人类免疫缺陷病毒(HIV)的易感性[1-4]。即时检测(POCT)试剂盒能够通过免疫色谱法检测生殖道的沙眼衣原体，可用于早期诊断，虽灵敏度(25%～65%)没有核酸检测方法高，但其可以快速得到结果，从而大大缩短检测和治疗之间的时间，并提高治愈率，不同生产厂家的试剂盒在灵敏度和特异度方面具有差异[5-8]。本研究对3种不同生产厂家的商品化沙眼衣原体POCT试剂盒进行方法学评价。

1 材料与方法

1.1标本来源

1.1.1BGMK细胞株 BGMK细胞株用于沙眼衣原体培养，购自英国南安普顿大学微生物系。细胞培养液为10%胎牛血清D-MEM(HyClone公司)，胎牛血清D-MEM购自Gibco公司。

1.1.2沙眼衣原体菌株 沙眼衣原体血清型D(D/IC-Cal-S/ON)和血清型E(E/DK-20/ON)，购自英国南安普顿大学微生物系。

1.1.3沙眼衣原体菌株培养 详细方法见文献[9-11]。BGMK细胞生长于75 cm2细胞培养瓶(NUNC公司)，待生长成为单层细胞后倾去细胞培养液，加入沙眼衣原体生长液，即10%胎牛血清D-MEM,含2 g/mL放线菌酮(Sigma公司)。然后分别接种沙眼衣原体血清型D和血清型E，接种完毕后离心细胞培养瓶，即1 600 r/min(700 g,Beckman J6-MC)35 ℃离心60 min。离心完毕后置于5% CO2和37 ℃培养72 h。倒置显微镜(Olympus IX71)下看见大量生长的沙眼衣原体包涵体。收获沙眼衣原体，即细胞刷(Corning-Costar公司)刮下感染细胞，超声波破碎感染细胞，1 600 r/min离心10 min去除细胞碎片，16 000 r/min高速离心10 min沉淀衣原体，再悬浮于0.2 mol/L 蔗糖磷酸盐缓冲液(2SP)，并在液氮内保存。

1.1.4沙眼衣原体浓度确定 BGMK细胞生长于含直径13 mm盖玻片的24孔细胞培养板(Corning-Costar公司)内，吸去细胞培养液，加入沙眼衣原体生长液。接种上述系列稀释的沙眼衣原体血清型D和E，然后离心24孔培养板，即2 400 r/min(1 500 g,Beckman J6-MC)35 ℃离心60 min。离心完毕后置于5% CO2和37 ℃培养48 h。吸去培养液，PBS洗涤2次，甲醇固定盖玻片10 min。抗沙眼衣原体单克隆抗体(Micro Trak,美国Syva公司)直接荧光法染色盖玻片，荧光显微镜(Olympus BX51)下计数包涵体数量，最终换算确定制备的沙眼衣原体血清型D和E浓度分别为1.86×1011IFU/mL和2.80×1011IFU/mL。IFU为包涵体形成单位。

1.2试剂 试剂盒A：衣原体抗原检测试剂盒(胶体金法，韩国Standard Diagnostics，Inc.)。试剂盒B：沙眼衣原体抗原检测试剂盒(乳胶免疫层析法，南京黎明生物制品有限公司)。试剂盒C：沙眼衣原体抗原检测试剂盒(胶体金法，上海凯创生物技术有限公司)。

1.3试验方法

1.3.1最低检出限检测 待测样本沙眼衣原体浓度：沙眼衣原体血清型D和血清型E冻存毒株，经细胞培养法滴定的浓度分别为1.86×1011IFU/mL和2.80×1011IFU/mL，化冻后使用生理盐水进行系列稀释，见表1。

表1 生理盐水进行系列稀释结果

比对方法：(1)2 970 μL生理盐水+30 μL毒株，即为10-2稀释，最终浓度为1.86×109IFU/mL。再取1.86×109IFU/mL沙眼衣原体300 μL+2 700 μL生理盐水，即为10-1稀释，稀释后浓度为1.86×108IFU/mL。以此类推至10-5稀释，最终浓度为1.86×106IFU/mL。先从10-2稀释开始，做好标识，每个浓度分别用加样枪加50 μL至各试剂盒配套拭子上。(2)分别将加样后的拭子，置于对应试剂盒的裂解液内，再滴入检测窗内，按照规定的时间读取结果。以此类推，每个浓度分别检测，直到3种试剂盒均为阴性检测结果。(3)在阴性结果的上一个稀释度(阳性检测结果)，使用生理盐水进行倍比稀释，如1.86×108IFU/mL，倍比稀释为9.30×107IFU/mL、4.70×107IFU/mL、2.30×107IFU/mL……同上方法，再次对每个浓度分别检测，最终确定每种试剂盒检测灵敏度的浓度绝对值。

1.3.2重复性比对试验 使用最终检测阳性结果的上一个滴度进行重复性试验，共计5次，由于沙眼衣原体毒株是活的微生物，且免疫层析方法POCT试剂盒制造及检测步骤简单，故仅进行批内重复性检测。

1.3.3特异度试验 待测样本：(1)人胚肺成纤维细胞MRC-5，浓度为2.9×106/mL，超声波裂解物。(2)非洲绿猴肾细胞系BGMK，系沙眼衣原体的培养细胞，浓度为5.0×106/mL，超声波裂解物。(3)标准菌株ATCC25922大肠埃希菌，采用新鲜纯培养菌株，用生理盐水调制成0.5麦氏单位浓度(1.5×108CFU/mL)菌悬液。试验方法:上述3个样本，不稀释，分别用加样枪加50 μL至各试剂盒配套拭子上，分别进行检测。

2 结 果

2.1最低检出限试验结果 对于沙眼衣原体血清型D的检测，试剂盒B和试剂盒C均能达到1.86×107IFU/mL，结果观察试剂盒B较试剂盒C阳性略明显一些(条带颜色更深)，试剂盒B在1.86×106IFU/mL也隐约可见条带，但试剂盒C在1.86×106IFU/mL无阳性迹象；试剂盒A仅能检测到1.86×109IFU/mL，并且条带颜色较另外两种试剂盒弱。见表2。对于沙眼衣原体血清型E检测，试剂盒B和试剂盒C均能达到2.80×107IFU/mL，但阳性均为弱阳性；试剂盒A仅能检测到2.80×109IFU/mL，并且条带颜色较另外2种试剂盒弱。

表2 最低检出限试验结果

注：w+表示弱阳性，+表示阳性，-表示阴性

2.2重复性比对试验结果 对于沙眼衣原体血清型D检测，试剂盒B和试剂盒C均能达到1.86×107IFU/mL，再进行2倍稀释后检测，2家结果均显示较弱阳性，因此，选择1.86×107IFU/mL进行重复性试验。试剂盒A仅能检测到1.86×109IFU/mL，并且条带颜色较另外2种试剂盒弱，再进行2倍稀释后检测，结果显示较弱阳性，因此，选择1.86×109IFU/mL进行重复性试验。见表3。

对于沙眼衣原体血清型E检测，试剂盒B和试剂盒C均能达到2.80×107IFU/mL，但为弱阳性，因此，从2.80×108IFU/mL进行2倍稀释为1.40×108IFU/mL和7.00×107IFU/mL后分别检测，2家结果1.40×108IFU/mL得到阳性结果，7.00×107IFU/mL仅得到弱阳性结果，因此，选择1.40×108IFU/mL进行重复性试验；试剂盒A仅能检测到2.80×109IFU/mL，并且条带颜色较另外2种试剂盒弱，再进行2倍稀释后检测，结果显示较弱阳性，因此，选择2.80×109IFU/mL进行重复性试验。3种试剂盒结果重复时均阳性，但是均存在阳性条带显示颜色强弱不完全一致的情况。

表3 重复性比对试验结果

2.3特异度试验结果 3种试剂盒在检测3种特异度干扰标本时均为阴性结果。见表4。

表4 特异度比对试验结果

3 讨 论

沙眼衣原体感染引起的性传播疾病在许多国家已跃居性传播疾病首位，在美国成为最常见性传播疾病，2015年上报病例数超过1 500 000例。欧洲筛查的无症状妇女沙眼衣原体感染的患病率为1.7%～17.0%[3-4]。我国性病流行以前以梅毒和淋病为主，近几年来，非淋球菌性尿道炎/宫颈炎的病例数已超过了淋病和梅毒，位居第1位。我国报道沙眼衣原体感染率为2.2%～10.0%，女性患病率更高[12]。目前核酸扩增法(CT NAATs)因其灵敏度和特异度均很好，常作为诊断沙眼衣原体感染的方法[13]。但许多实验室不具备开展分子生物学检测条件，需要进行快速初筛时，采用最多的是胶体金免疫层析法。有文献报道POCT的成本效益比核酸扩增法更优，对公众健康的益处更大[7-8]。目前，国家食品药品监督管理总局(CFDA)批准的沙眼衣原体抗原检测试剂盒共有11个品种，质量参差不齐，POCT沙眼衣原体检测试剂盒存在灵敏度低的问题，从中找到质量好(灵敏度及特异度均高)且价格合理的试剂盒非常重要。

目前,国内从事沙眼衣原体筛查的实验室很少具备培养沙眼衣原体的条件，对试剂盒的评估手段有限，选择试剂盒较为盲目。本文评价方法简单有效，本实验结果可作为实验室选择试剂盒的参考依据。

沙眼衣原体体可分为很多血清型，其中沙眼衣原体A、B、Ba、C血清型可引起沙眼，D～K血清型可引起泌尿生殖道感染[14-16]。国内沙眼衣原体血清型D和E 是泌尿生殖道感染中较常见的血清型，国内上市的免疫层析法(包括POCT)快速检测沙眼衣原体试剂盒，临床主要用于男女生殖道沙眼衣原体感染的检测。本实验室保存了来自英国南安普顿大学微生物系的沙眼衣原体血清型D(D/IC-Cal-S/ON)和血清型E(E/DK-20/ON)，因此，选择血清型D和E进行本次实验。

通常灵敏度和特异度是使用和评价试剂盒的重要参数。人胚肺成纤维细胞MRC-5细胞系来自14周龄男性胎儿的正常肺组织，系人源细胞系。当采集生殖道标本用于沙眼衣原体快速检测时，标本中会含有数量不等的人源上皮细胞，因此，有必要验证试剂盒是否对高浓度人源细胞裂解物存在交叉反应。非洲绿猴肾细胞系从非洲绿猴的肾脏上皮细胞中分离培养出来，常用于沙眼衣原体的培养，采用非洲绿猴肾细胞系作为干扰物是验证用于培养的组织细胞成分是否对试剂盒检测有干扰。大肠埃希菌为引起泌尿生殖道感染最常见病原菌，约75%的尿路感染由大肠埃希菌引起，选择大肠埃希菌作为干扰物来验证试剂盒是否受到其他泌尿生殖道常见病原体的干扰。在特异度方面，本次试验结果显示，3种试剂盒均能够抗人胚肺成纤维细胞MRC-5(2.9×106/mL)，非洲绿猴肾细胞系BGMK(浓度为5.0×106/mL)和标准菌株ATCC25922大肠埃希菌(1.5×108CFU/mL)的干扰。在重复性方面，3种试剂盒也无差异。灵敏度方面，笔者确定了3种不同厂家的商品POCT试剂盒在检测沙眼衣原体时的真实检出限，即绝对浓度，以IFU/mL表示，反应试剂盒的真实灵敏度，为本实验室及其他医疗机构实验室选择检测试剂盒提供参考。本次实验结果中，3种试剂盒均未达到非常理想的水平。对于沙眼衣原体血清型D的检测，试剂盒B和试剂盒C均能达到1.86×107IFU/mL，结果观察试剂盒B较试剂盒C阳性略明显(条带颜色更深)，试剂盒B在1.86×106IFU/mL隐约可见条带，但试剂盒C在1.86×106IFU/mL无阳性迹象；试剂盒A仅检测到1.86×109IFU/mL，且条带颜色较另外2种试剂盒弱。对于沙眼衣原体血清型E检测，试剂盒B和试剂盒C均能达到2.8×107IFU/mL，但均为弱阳性；试剂盒A仅能检测到2.8×109IFU/mL，且条带颜色较另外2种试剂盒弱。综上所述，本研究显示检测检出限方面，试剂盒B和试剂盒C明显优于试剂盒A，试剂盒B略优于试剂盒C。

一般医疗机构实验室评估沙眼衣原体PCCT试剂盒的手段有限，选择试剂盒较为盲目，本研究采用保存的沙眼衣原体株确定了3种不同厂家的商品POCT试剂盒在检测沙眼衣原体时的真实检出限，即绝对浓度，反应了试剂盒的真实灵敏度，并且采用可能相关干扰物进行特异度评价，方法科学简单有效，为其他医疗机构实验室选择检测试剂盒提供具体可靠的参考依据。