B6-Co小鼠眼睑成纤维细胞增殖、凋亡及迁移能力实验研究

景 瑾, 张海骏,, 杜利莉, 姬桂青, 邵义祥

(1. 南通大学比较医学研究所, 南通 226001;2. 南通大学江苏省神经再生重点实验室, 南通 226001)

眼睑有保护眼球的作用。任何可能造成眼睑发育障碍、组织缺损、位置异常和眼睑启闭功能障碍的病变，都可影响眼睑的正常生理功能，以致失去保护眼球的作用，危及眼球的安全[1]。眼睑功能异常会导致眼睛的各种疾患，如角膜炎、角膜混浊、上睑下垂等。而导致这些眼病的因素有感染、遗传、营养不良、外伤等多种因素[2]。要研究这些因素对视觉功能的影响，以及各因素的叠加影响、相互作用等等，都必须借助疾病动物模型来深入研究。

南通大学实验动物中心[3]用C57BL/6J(B6)背景品系小鼠自主培育建立的遗传稳定的C57BL/6J-corneal opacity (B6-Co)突变系小鼠, 与国内[4]和国际[5]上研究的出生时眼睑开放(eye open at birth，EOB)表型的模型小鼠相似，即在出生时眼睑闭合不全。正常B6小鼠胚胎在妊娠16.5～18.5 d时完成眼睑融合，出生时眼睑闭合，出生后12～14 d睁眼。而B6-Co突变系小鼠在妊娠期胚胎未能顺利完成眼睑的融合，并保持开放状态直至出生，即呈典型的EOB表型[6]。Wu等[7]研究表明，B6-Co小鼠眼睑角质形成细胞伪足形成受到影响，使得该突变系小鼠胚胎妊娠16.5～18.5 d未能完成眼睑融合，导致了EOB表型。卢泽艳等[8]首次成功培养B6-Co小鼠眼睑角质形成细胞，发现其迁移能力显著降低，形成细胞迁移障碍，引起了EOB表型。但眼睑组织中的另一类型的主要细胞是成纤维细胞，该类型细胞在B6-Co小鼠眼睑形态建成中有何变化与影响呢？本实验拟通过培养正常B6小鼠和B6-Co小鼠成纤维细胞，对小鼠眼睑成纤维细胞增殖、凋亡及迁移能力进行比较研究，从而为阐明先天性眼睑发育异常的形成机制提供实验依据，也可为人类遗传性眼睑疾病、角膜病的早期诊断、预防和治疗提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 实验动物

SPF级B6、 B6-Co小鼠由南通大学实验动物中心提供[SCXK (苏) 2014-0001]; 饲养在SPF级屏障动物房内, 室内温度(21±1) ℃, 相对湿度(55±5)%,自由采食和饮水, 昼夜明暗交替时间12 h/12 h, 定期更换笼具、垫料[SYXK(苏)2015-0016]。B6 雄性与B6雌性小鼠以 1∶2 比例配对, 共10笼; B6-Co雄性小鼠与B6雌性或B6 雄性与B6-Co雌性小鼠以1∶2 比例配对，共10笼。每日上午8点之前检查小鼠阴道栓。见栓当日胚龄记为 0.5 d。

1.2 主要仪器及试剂

CO2细胞培养箱购自美国Thermo公司; 倒置相差显微镜购自德国Leica公司; 抗菌素、体积分数0.25%胰蛋白酶-EDTA和体积分数0.25%胰蛋白酶均购自美国Gibco公司; 胎牛血清和DMEM基础培养基均购自美国Hyclone公司; CCK8试剂盒和Annexin V-FITC细胞凋亡检测试剂盒均购自中国碧云天生物技术公司; Vimentin一抗购自英国Abcam公司。

1.3 方法

1.3.1 小鼠眼睑成纤维细胞的分离和培养 取妊娠18.5 d的母鼠，颈椎脱臼处死后放入体积分数75%的乙醇溶液浸泡5 min消毒待用; 剖开孕鼠腹部，取出胎鼠(B6-Co小鼠需判断其眼部开合状态，开则为EOB表型小鼠，闭眼则弃去); 用镊子取下小鼠的眼睑组织, 剪刀剪碎; 加2 mL胰酶，于37 ℃消化5 min; 100目网筛过滤, PBS冲洗; 离心, 弃上清;完全培养基重悬沉淀，于37℃、体积分数5% CO2培养箱培养; 待原代细胞长满后，细胞1∶2传代。

1.3.2 小鼠眼睑成纤维细胞的鉴定 在细胞培养至第3代时，取部分细胞于圆玻片上进行细胞爬片培养; 待细胞长至适当密度时，吸除培养基，PBS轻洗细胞2次×3 min，再加入质量分数4%多聚甲醛固定20 min，PBS轻洗细胞3次×3 min; 体积分数0.5% Triton X-100通透20 min，PBS轻洗细胞3次×3 min; 体积分数3%H2O2室温15 min，PBS轻洗细胞3次×3 min; 5%BSA封闭0.5 h; 滴加一抗(1∶100)，4 ℃孵育过夜，PBS轻洗细胞3次×3 min; 滴加二抗(1∶200)，37℃反应30 min，PBS轻洗细胞3次×3 min; 二氨基联苯胺(DAB)底物显色，室温下避光孵育10 min，纯水洗细胞; 苏木精染核2 min。 纯水轻洗细胞4次×5 min; 依次放入体积分数70%乙醇溶液2 min、体积分数90%乙醇溶液2 min、无水乙醇2 min、二甲苯酒精5min、二甲苯5min，封固。

1.3.3 小鼠眼睑成纤维细胞增殖水平的检测 取对数生长期细胞, 胰酶消化后离心收集, 重悬细胞, 细胞计数调整为 2×104/mL。将制备好的细胞悬液边轻轻混匀边加入96孔板，每孔加入 100 μL; 将接种好的细胞培养板放入培养箱中培养过夜，空白对照组只加入培养基不加细胞, 每组设6个复孔取均值, 实验重复3次。在培养1d、2d、3d和4 d、5 d后CCK8法测细胞活力; 不同时间组及对照组每孔加入10 μL CCK8 溶液，培养箱继续孵育约2 h，在酶标仪450 nm 处测量各孔的吸光度(A)值。

1.3.4 小鼠眼睑成纤维细胞凋亡水平的检测 取对数生长期细胞，种于6孔板中，待细胞长至约80%时，将6孔板内各孔的培养基收集至相应离心管中;用PBS洗涤细胞两遍，洗涤液也回收至离心管内;加入100 μL不含EDTA的胰酶，消化4～5 min，镜下看见细胞变圆时加入适量完全培养基终止消化，吹打数次；吸取细胞消化液至上述离心管，1 200 r/min, 离心5 min; 小心倒去上清液, 加入适量PBS洗涤，离心，重复2次; 去除上清液，各离心管加入100 μL 缓冲液，重悬细胞，然后依次加入两种染液AV和PI各5 μL，并设3个对照组，分别为空白单染PI、空白单染AV、及全空白组，分别加入PI、AV及缓冲液5 μL; 各组细胞轻微混匀，室温下避光反应20 min; 各加入400 μL缓冲液，通过400目细胞滤网过滤，上机检测; 以右上象限为晚期凋亡细胞和右下象限为早期凋亡细胞，每组细胞3个复孔，重复3次。

1.3.5 小鼠眼睑成纤维细胞迁移能力的检测 本实验选用直径6.5 mm、孔径8 μm的Transwell小室;0.25%胰酶将处于对数生长期的细胞消化, 以DMEM基础培养基重悬并调整细胞密度至5×105/mL; 加100 μL细胞悬液至Transwell上室，加入500 μL DMEM培养基(含5%胎牛血清)至Transwell下室，于CO2培养箱中培养24 h; 取出Transwell小室，吸尽培养基，PBS清洗3次; 放入质量分数4%多聚甲醛溶液中固定20 min; 弃固定液，PBS摇床洗10 min; 放入结晶紫中室温染色10 min; PBS轻洗2次, 每次5 min; 用脱脂棉擦去小室上表面细胞, 显微镜下取5个视野拍照计数, 以备后续统计、分析。

1.4 统计分析

所有实验计量数据均采用STATA V 10.0统计学软件进行处理，应用GraphPad Prism 5统计分析软件进行统计作图。数据结果用s表示，采用配对t检验，P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 小鼠眼睑成纤维细胞的形态

倒置相差显微镜下观察，B6-Co、B6小鼠眼睑所取细胞外形上无明显差异(图1)，细胞均多为梭形，核大多位于胞质中央，且大小均一，细胞集落性生长，呈涡旋样或平行样排列，符合成纤维细胞特征。

2.2 小鼠眼睑成纤维细胞的鉴定

成纤维细胞的标志蛋白是波形蛋白(Vimentin)，因此通过免疫组织化学染色法鉴定所分离的细胞及其纯度。B6-Co、B6小鼠眼睑组织胰酶消化所得的细胞100%表达成纤维细胞特征蛋白Vimentin(图2),Vimentin表达于胞质中且呈棕黄色，苏木精染核呈蓝色，细胞呈梭形，符合成纤维细胞特征。本实验成功培养出B6-Co、B6小鼠成纤维细胞，且没有杂细胞污染。

2.3 CCK-8法检测小鼠眼睑成纤维细胞增殖能力

B6-Co组成纤维细胞在培养1 d、2 d、3 d、4 d和5 d后细胞增殖水平(A450值)显著低于B6组(P＜0.01)(表1)。这表明B6-Co小鼠眼睑成纤维细胞增殖能力有显著缺陷。

2.4 Annexin V-FITC法检测小鼠眼睑成纤维细胞的凋亡能力

通过流式分析检测B6组、B6-Co组成纤维细胞的凋亡情况，以右上象限代表晚期凋亡细胞，以右下象限代表早期凋亡细胞，根据细胞所占比例计算凋亡率(图3)，与B6组成纤维细胞相比，B6-Co组的早期凋亡比例极显著上升(P＜0.01)，这说明B6-Co小鼠眼睑成纤维细胞更易凋亡。

2.5 Transwell检测小鼠眼睑成纤维细胞迁移能力

通过Transwell迁移实验来测定B6-Co、B6成纤维细胞的迁移能力，结果(图4)显示，B6-Co组的成纤维细胞在Transwell小室接种培养24 h后，其穿过小室的细胞数量极显著低于B6组(P＜0.01)，这表明B6-Co小鼠眼睑成纤维细胞迁移能力受到严重影响。

图1 B6-Co、B6小鼠眼睑成纤维细胞形态观察Figure 1 Morphology of eyelid fibroblasts in B6-Co and B6 mice

图2 B6-Co、B6小鼠眼睑成纤维细胞的鉴定Figure 2 Identification of eyelid fibroblasts in B6-Co and B6 mice

表1 B6-Co、B6小鼠眼睑成纤维细胞增殖能力的检测Table 1 Detection of proliferation ability of eyelid fibroblasts in B6-Co and B6 mice

3 讨论

先天性角膜混浊[9]是人类较为常见的眼部疾病之一，多为眼睑发育缺陷所引起[10]。角膜混浊可以发生在角膜中央或周边部，甚至弥漫于全角膜，并伴有眼部其他发育异常，最终引发失明[11]。因此，眼睑发育机制一直受到发育生物学、眼科学研究者的高度关注。本研究所采用的角膜混浊表型的B6-Co小鼠，在胚胎发育后期，上下眼睑融合失败, 导致小鼠出生时眼睑闭合不全，出生后极易发生角膜炎，并逐步发展为角膜混浊，其病理发展过程与人类角膜混浊的病理发展过程极为相似，是研究人类角膜病的良好动物模型，也是研究眼睑发育生物学及其分子调控机制的极好动物模型。

成纤维细胞是疏松结缔组织的主要细胞成分[12],其功能活动旺盛，细胞质嗜弱碱性，表现为明显的蛋白质合成和分泌活动。成纤维细胞是皮肤真皮网织层中最重要的细胞，常附着在胶原纤维上，能合成和分泌大量胶原蛋白，对维持皮肤的功能具有重要作用。此外，成纤维细胞还对不同程度的细胞变性、坏死和组织缺损的修复有着重要作用[13]。而细胞增殖是细胞的重要生理功能之一，是生物体的重要生命特征。细胞的增殖是生物体生长、发育、繁殖以及遗传的基础。本实验研究表明，B6-Co小鼠的眼睑成纤维细胞增殖能力极显著低于B6小鼠，是造成该突变系小鼠出生时眼睑不能闭合的重要原因之一。与Curtain等[14]曾报道的成纤维细胞影响小鼠眼睑发育，引发眼睑融合失败的结果相一致。

图3 B6-Co、B6小鼠眼睑成纤维细胞凋亡能力的检测Figure 3 Detection of apoptosis of eyelid fibroblasts in B6-Co and B6 mice

细胞凋亡是为维持内环境稳定，生物体细胞主动消亡的过程，是细胞生物体维持机体平衡的关键。细胞凋亡在多细胞生物去除不需要的或异常的细胞中起着必要作用[15]，在生物体进化、内环境稳定以及多个系统发育中发挥重要作用，但过度凋亡则会引起机体发育缺陷等一系列问题。在本实验中，B6-Co小鼠眼睑成纤维细胞的早期凋亡比例比B6小鼠极显著上升。

细胞迁移也称细胞爬行，是指细胞在接收到迁移信号或感受到某些物质的梯度后产生的移动。细胞迁移为细胞头部伪足的延伸、新的黏附建立、细胞体尾部收缩在时空上的交替过程。细胞迁移是正常细胞的基本功能之一，是机体正常生长发育的生理过程，在胚胎发育、伤口愈合、免疫反应等生理过程中发挥重要作用[16]。本研究分析比较了B6-Co小鼠与B6小鼠眼睑成纤维细胞迁移能力的差异，发现B6-Co小鼠的眼睑成纤维细胞迁移能力极显著低于B6小鼠, 迁移能力受到严重阻碍。

图4 B6-Co、B6小鼠眼睑成纤维细胞迁移能力的检测Figure 4 Detection of migratory ability of eyelid fibroblasts in B6-Co and B6 mice

实验结果表明，B6-Co小鼠眼睑成纤维细胞虽然在形态上与B6小鼠眼睑成纤维细胞没有明显差异, 但是增殖和迁移能力都显著下降, 且凋亡水平显著上升。结果提示, B6-Co小鼠出生时眼睑闭合不全与其胚胎发育期间眼睑成纤维细胞的增殖能力、凋亡水平及迁移能力的改变有一定的关联，但其关联程度及影响B6-Co小鼠眼睑成纤维细胞增殖、凋亡、迁移的分子调控机制仍有待深入研究。