新生乳兔右心室超负荷模型的初步构建和分析

2019-07-15王守宝

实验动物与比较医学 2019年3期

丁雷, 王守宝, 荆辉, 李垚

(1. 上海儿童医学中心, 上海 200127; 2. 上海交通大学医学院, 上海 200025)

右心室(RV)后负荷增加和随后出现的功能障碍,多见于伴有心室水平左向右分流的肺动脉高压、右室流出道梗阻性疾病(如法洛四联症等)和RV作为循环心室的疾病(如左心室发育不良)等先天性心脏病患儿。后负荷增加早期可导致RV代偿性或适应性肥大, 但持续的后负荷增加则使RV出现失代偿性或适应不良性肥大, 最终导致RV功能障碍, 临床上表现为RV充盈不良或射血功能减退。虽然RV超负荷导致心室重塑的过程和机制, 在成年动物模型中已得到广泛研究[1-3], 但由于缺乏合适动物模型, 目前对新生哺乳动物RV肥厚和衰竭的过程和机制知之甚少。

众所周知，未成熟和成熟的心肌细胞在许多生理、生化特性方面存在差异[4]。未成熟心肌细胞内含有丰富的糖原颗粒，其更依赖于糖酵解产生的三磷酸腺苷；同时未成熟心肌细胞亦更依赖于细胞外钙离子触发兴奋-收缩耦联和维持细胞内钙稳态[5-8]。最近研究[9,10]表明，哺乳动物心脏可以在出生后1周内通过心肌细胞增殖再生，应对物理损伤和缺血性损伤。鉴于未成熟心肌细胞的上述生物学特征，成年动物模型所获得的实验结论并不适合直接应用在未成熟心肌细胞上。因此，构建新生哺乳动物RV超负荷模型具有重要的临床意义。

目前常见的幼年RV超负荷模型包括：缺氧/野百合碱诱导肺动脉高压，进而导致RV超负荷或幼年猪肺动脉环缩(PAB)模型[11-13]。上述这些方法均不能在出生后立即导致RV超负荷。前者需要数周才能发展为肺动脉高压, 而后者从未报道在新生大型动物上实施手术。考虑到乳兔体型小、花费少及饲养简便, 本研究试图对乳兔实施PAB术, 探讨环缩新生乳兔肺动脉是否能成功构建出新生兔RV超负荷模型; 同时通过术后超声心动图、血流动力学测量以及组织学染色, 对所建立的RV超负荷模型进行了病理学及病理生理学分析评价。

1 材料与方法

1.1 实验动物

普通级新西兰孕兔5只，由上海市松江区松联实验动物场提供[SCXK(沪)2017-0008]。孕兔分娩后，从5窝新生乳兔(不区分雄性和雌性)中随机选择30只分成2组： PAB组15只实施PAB手术，而假手术(Sham)组15只乳兔除肺动脉环缩步骤外，其余操作与PAB组相同。动物饲养于上海交通大学医学院[SYXK(沪)2018-0027]。动物实验方案经过上海交通大学医学院实验动物饲养与管理委员会审核通过，并严格按照申请的实验方案执行。

1.2 主要实验试剂和仪器设备

4-0丝线、6-0丝线购自宁波医用缝线有限公司; 异氟烷购自上海玉研科学仪器有限公司; 苏木素&伊红(HE)染色试剂盒购自武汉百奥斯生物科技有限公司; 小动物彩色超声成像系统(Vevo 2100)购自加拿大Visual Sonic公司; 电敏加热板(PhysioSuite)购自美国Kent Scientific公司; 小动物麻醉诱导系统(Matrx VIP3000)购自美国Midmark公司; 显微镜(BX60)购自日本Olympus公司; 压力-容积检测系统及4.5 mm右心导管(MPVS Ultra)购自美国Millar Instruments公司。

1.3 麻醉和止痛方法

将新生乳兔置于麻醉诱导箱中使用体积分数5%异氟烷(0.2 L/min氧气)诱导麻醉。随后转移到手术台上，面罩吸入体积分数1.5%～2.0%异氟烷(0.2 L/min氧气)维持麻醉，将动物以仰卧位固定于手术显微镜下方、加热板上直至手术完成。术后通过给哺乳母兔注射曲马多(5 mg/kg)，经过乳汁分泌对手术动物进行止痛(参考美国FDA盐酸曲马多使用指南)。

1.4 手术方法

体积分数75%乙醇消毒颈胸部皮肤后，于左胸侧第二、三肋间隙处切开皮肤，剪断部分胸大、胸小肌和肋间肌进入胸腔，并用眼睑撑开器撑开肋间隙，此过程注意保护左侧胸廓内动脉。随后在立体显微镜下用显微器械分离胸腺组织，打开心包，将左心耳翻向左侧后，即可暴露出肺动脉主干，用显微剪将肺动脉和主动脉之间的间隙分开以便穿过环缩线。将6-0丝线从肺动脉和主动脉之间的间隙进入，从肺动脉下方穿过，在肺动脉与左心耳之间穿出, 形成完整的闭环。最后将23G针头(直径0.63 mm)平行置于肺动脉上, 然后将肺动脉和针头一起打结, 并快速移除针头，至此环缩后的肺动脉直径约等于针头的直径。打开的肋间隙用4-0丝线缝合。新生乳兔脱离麻醉, 加热板上缓慢苏醒, 完全苏醒后转移回母兔身边。整个过程持续约16 min。除环缩步骤外, Sham组操作同PAB组。

1.5 超声心动图检测

为明确肺动脉狭窄情况, 于术后14 d行经胸超声心动图检查。Sham组和PAB组各随机选取6只乳兔，使用体积分数5%异氟烷(0.2 L/min氧气)诱导麻醉后，将动物仰卧位固定于检测平台上，四肢与导联电极贴合, 面罩吸入体积分数1.5%～2.0%异氟烷(0.2 L/min氧气)维持麻醉。检测时，在肺动脉长轴视图下测量肺动脉收缩期峰值压力梯度(PPG)。所有测量结果均由经验丰富的超声仪器操作技师从3次连续心动周期中获得。为排除人为偏倚，对送检人员和超声仪器操作技师采用双盲。

1.6 血流动力学检测

为明确RV血流动力学情况，于术后14 d行心导管检测。具体检测方法：经同上麻醉方案后，行胸骨正中切开术和心包切开术，用27G针刺破RV。将心导管插入孔中并定位于流出道。用配套的Power Lab系统记录数据，并通过LabChart 7.0软件进行分析。

1.7 组织病理学观察

在术后14 d完成超声心动图和血液动力学检测后，通过穿刺针抽取血液并迅速切除心脏，置于质量分数4%多聚甲醛固定过夜。然后，常规组织切片，行HE染色。染好切片用CaseViewer扫描系统扫描并记录。RV游离壁厚度(RVWT)测量位置选择三尖瓣下缘处。

1.8 统计分析

所有统计学分析采用SPSS17.0统计软件进行。定量数据以s表示，多组间及两组间比较分别采用单因素方差分析(One way-ANOVA)及Student t检验，P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 存活率

3只乳兔(PAB组2只, Sham组1只)术后未能苏醒, 手术成功率为86.67%。随后2 d内有2只乳兔(PAB组与Sham组各1只)死于母兔踩踏。术后14 d,Sham组有13只存活, 而PAB组有12只存活, Sham组和PAB组的存活率分别为86.67%和80.00%。

2.2 超声心动图结果

PAB术后14 d，即可检测到乳兔肺动脉的缩窄(图1A，黄色箭头)。在环缩部位和狭窄后区域，可观察到不规则的彩色图案，表明狭窄可导致血液出现湍流(图1A)。在肺动脉长轴视图下通过连续波多普勒测量肺动脉收缩期PPG，结果显示, PAB组的PPG比Sham组平均增加21倍(图1B)。PAB组的PPG在术后14 d为(34.05±5.66) mmHg，Sham组仅为(1.62±0.21) mmHg (图1B)，表明在PAB手术后RV的后负荷显著增加(P＜0.01)。

图1 乳兔假手术(Sham)和PAB手术后14 d超声心动图像观察

2.2 血流动力学结果

相较Sham组, PAB组乳兔在术后14 d右心室收缩压显著增加, PAB组的RV收缩压为(45.25±5.26) mmHg, 显著高于Sham组的(10.43±1.27) mmHg(P＜0.05), PAB组的RV舒张压为(8.74±1.29) mmHg,也明显高于Sham组的(3.86±0.61) mmHg (P＜0.05)。

2.3 组织学观察

HE染色显示，PAB组心脏在术后14 d显著增大(图2A)。此外，高倍镜下可观察到PAB组心脏心肌纤维稍紊乱，心肌细胞核增大(图2C)，说明乳兔PAB后心肌细胞出现了重塑。

术后14 d对Sham组和PAB组RVWT进行测量，Sham组在三尖瓣下缘处的RVWT为(0.73±0.12) mm，PAB组对应位置的厚度增加至(1.42±0.27)mm (P＜0.05)。

3 讨论

许多先天性心脏病患儿在出生后即存在RV超负荷，如肺动脉高压、右室流出道梗阻以及RV作为循环心室的疾病。出生后随着肺的膨隆，肺循环外周阻力显著降低，并导致动脉导管和卵圆孔关闭。而患有上述疾病的患儿出生后即承受持续的RV高压力或容量超负荷。考虑到未成熟心肌和成熟心肌之间细胞和分子特征的差异，本研究试图构建新生乳兔的RV超负荷模型，以便更好地模拟出生后即刻出现的RV超负荷。

术后14 d PAB和Sham组的存活率分别为80%和86.67% ，表明新生乳兔对PAB手术具有相当的耐受性。尽管如此，在PAB期间也应特别小心，避免损伤大血管，因此，建议在显微镜下进行手术操作。与成年PAB模型相比，新生乳兔PAB 模型的RV重塑进展要更迅速。术后14 d所有经过PAB的动物均发生显著的RV肥大, 而成年PAB模型[14-24]要在4周之后才能观察到显著的RV肥厚。乳兔PAB后RV血流动力学变化程度也更为显著，与成年PAB动物RV舒张压约2倍的增加相比[14-20], 新生PAB兔的RV舒张压平均增加了约4倍。乳兔PAB术后RVWT的变化也更加明显，成年动物PAB术后RVWT较术前约增加1倍，而新生兔PAB术后RVWT较术前增加了约2倍[14-20]。