不同强度的耐力运动对大鼠心肌细胞膜ATP敏感性钾通道亚基Kir6.1和Kir6.2基因表达的影响

邓友贵



不同强度的耐力运动对大鼠心肌细胞膜ATP敏感性钾通道亚基Kir6.1和Kir6.2基因表达的影响

邓友贵

（东莞市南华职业技术学校， 广东 东莞 523932）

建立大鼠不同强度耐力运动模型，以SD大鼠心肌细胞膜ATP敏感性钾通道为观察对象，从分子水平探究不同强度的耐力运动对大鼠心肌细胞膜sarcKATPC亚基Kir6.1和Kir6.2表达量的变化。通过探讨发生这些变化的原因，为更好地指导体育运动实践，进一步探讨心肌保护机制和揭示运动训练规律提供理论依据。

ATP敏感性钾通道；耐力运动；基因表达

近年来，运动和健康的研究正在广泛的开展，随着生命科学的发展，人类基因-基因组学，蛋白质-蛋白质组学，成为当前生命科学的研究热点。随着人类后基因组计划的开展，耐力运动与心肌基因表达的研究也在不断开展，将来必定在运动人体科学领域产生深远的影响。

1 实验材料与方法

1.1 实验材料

健康雄性SD大鼠60只,4-8周龄,体重在110-130g，将SD大鼠随机分为4组，即安静对照组（X组）、高强度组(C组)、中强度组(B组)、低强度组(A组)，安静组12只，其它三组均为15只，饲养环境为室温（20±2）℃，光照时间10小时，相对湿度为25%-35%。

1.2 实验方法

运动模型参照Tanaka,etal.2003的方法制备，采用耐力运动制备运动性心肌损伤模型，运动方式为跑台，通过跑速、跑台坡度控制强度。训练结束后立即注射20%乌拉坦麻醉后，冰上解剖取材。训练安排：安静对照组常规分笼饲养，不进行耐力性运动，其余三组一周进行六天耐力训练，训练后放回笼中休息，训练前后称重。低强度组的训练在时间上与中、高强度组基本一致，但跑台速度和坡度有区别，低强度组跑台速度、坡度均不变，中、高强度组的训练随时间的推移运动速度相应地增加，训练8周后进行动物处理。

2 结果与分析

2.1 逆转录-聚合酶链式反应（RT-PCR）

2.1.1 引物设计

根据Genbank登录的基因mRNA序列，应用primer5.0软件进行引物设计，分析其二级结构并做BLAST分析其特异性，并获取扩增鼠内参β—actin，设计的引物合成后，于-20℃条件下保存，引物序列如表1所示。

表1 引物序列

PrimersSequenceAAccession number Kir6.1F：5’-TGACTGAGGAGGAGGGAGTG-3’NM-017099.4 R：5’-CTCTTTTGGAGGGTCTGAATC-3’ Kir6.2F：5’-CAAGCCCAAGTTTAGCATCTCT-3’NM-031358.3 R：5’-GCACCCCAGCACTCTACATAC-3’ β-actinF：5’-TGTCACCAACTGGGACGATA-3’AC-000080.1 R：5’-GGGGTGTTGAAGGTCTCAAA -3’

2.1.2 总RNA的提取

(1) 切取30-50mg组织，加入1000µl的 TotalRNA充分研磨，将匀浆液转入离心管中，加入200µl的氯仿，剧烈震荡10sec，手动混匀2min。(2) 将裂解后样品或匀浆液室温放置5-10min,使得核蛋白与核酸完全分离。(3) 按适当比例加入氯仿，手动剧烈振荡管体15Sec后，手动颠倒混匀2min，室温放置3min。4℃下12000rPm离心10min。(4) 吸取上层水相转移到新的干净离心管中。水相与同等体积异丙醇混合以沉淀其中的RNA，混匀后室温放置20min。(5) 室温放置20min后，于4℃12000rpm离心10min。(6) 加入lml75%乙醇清洗RNA沉淀，4℃12000rpm离心3min，移去上清液。室温干燥5-10min。(7) 加入30-50µl RNase-free ddH2O,充分溶解RNA沉淀，55-60℃孵育10min。

2.1.3 逆转录合成cDNA

将提取的总RNA逆转录为cDNA，按试剂盒说明书严格进行操作，配制RT反应液，并加到0.2ml的RT反应管中。

表2 RT反应体系

ComponentVolume(µl) Control GAPDH RNA(50ng/µl)2µl Oligo(dT)18 Primer1µl or Random Hexamer Primer or Reverse GAPDH Primer1µl 5×reaetion buffer4µl RiboLock RNase Inhibitor(20u/µl)1µl 10mM dNTP mix2µl RevertAid M-MuLV Reverse Transcriptase(200u/µL)1µl Water,nuclease-free9µl Total volume20µl

以上反应液的总体积为20µl，将反应液手动混匀，离心一分钟，在PCR扩增仪上按以下条件进行RT反应：70℃5min，42℃60min，4℃30min。RT产物为第一链cDNA。

2.1.4 PCR扩增Kir6.1，Kir6.2和β-actin：取逆转录产物2µl进行PCR反应。

表3 PCR反应体系

ComponentVolume(µl) cDNA2µl 10×PCR buffer5µl 10mM dNTP Mix1 µl 10mM上游引物1.5µl 10mM下游引物1.5µl 25mM MgCl23 µl Taq DNA polymerase(5u/µL)0.5µl Water,nuclease-free35.5µl Total volume50µl

将以上反应液离心混匀再进行PCR反应,PCR反应条件如表4所示。

表4 PCR反应条件

SteptemperatureTimeNumber of cycles Initial/denaturatian94℃3min1 Denaturatian94℃30S36 Annealing58℃30S36 Extension72℃60S36

72℃延伸5min，从第二步到第四步循环36次,目的基因Kir6.1和Kir6.2以及内参β-actin的扩增片段不同组别大小不一样，具体见图表数据分析。

2.1.5 琼脂糖凝胶电泳检测RT-PCR结果

1h36min的PCR反应后，取PCR扩增产物10µl与6x Loading Buffer 2µl混匀加入点样孔，凝胶电泳80min后取出凝胶放入成像分析仪中，成像观察、拍照并处理数据。PCR的扩增曲线基本拟合良好，电泳条带比较模糊，但四组的基因表达未见显著差异，说明PCR反应体系较稳定，结果可靠。凝胶电泳分析，B组内参的条带比较清晰，但目的基因的表达条带模糊，有重叠现象，Kir6.2的表达，部分条带不在Maker范围内，如图1、2所示。

图1 B组Kir6.1表达

图2 B组Kir6.2 表达

注：琼脂糖凝胶电泳检测RT-PCR结果：低强度组（A），中强度组（B），高强度组（C），安静对照组(X)，Market左边的条带为内参，右边数字代表基因条带，DNA Marker （从上而下大小依次为600bp、500bp、400bp、300bp、200bp、100bp）。

经成像分析系统处理后，发现C组Kir6.1和Kir6.2表达量都很少，内参基因的表达量很弱，图像上的条带模糊，能看见一丝白色的斑点，两个目的基因的条带都有重叠现象，X组的内参基因表达条带比C组更模糊，几乎是不表达，如图3-4所示。

图3 C组Kir6.1表达

图4 C组Kir6.2表达

2.1.6 RT-PCR检测Kir6.1 和Kir6.2表达的结果分析

表5 各组心肌Kir6.1和Kir6.2的表达

GroupnKir6.1Kir6.2 低强度（A组）80.44±0.130.48±0.13 中强度（B组）80.48±0.020.64±0.41 Δ 高强度（C组）80.38±0.09 *0.50±0.01 安静对照（X组）81.00±0.010.29±0.03

注：*表示与安静对照组相比有显著性差异，Δ表示与安静对照组相比具有显著性差异（p<0.05）

Kir 6.1表达结果显示：四个组的表达量都不高，但安静对照组的表达水平与中底高强度耐力组相比要上调，不同强度组里表达量最高的是中强度组，高强度与中强度组的表达量没有显著性差异，强度与表达量成反比关系，安静对照组与高强度相比具有显著性差异（P<0.05），ABC三组表达水平下调，但三组之间表达无显著性差异。可见在转录过程中可能Kir6.1mRNA降解，不同强度的耐力运动能抑制Kir6.1的生成，中高强度耐力运动造成大鼠比较严重的心肌损伤，但强度不同表达水平区别也不大。

经过2（-delta delta c(t)）方法计算后得出数据：X组Kir6.1表达量是A组的2.27倍；X组Kir6.1分别是B组、C组的2.08倍、2.63倍;B组Kir6.1是C组的1.26倍；A组Kir6.1是C组的0.12倍（如图5-6所示）。

图5-6 各组心肌细胞膜Kir6.l和Kir6.2表达相对比值

Kir6.2表达结果显示：四个组的Kir6.2与Kir6.1的表达量相当，从上述分析中得出Kir6.1的表达量最高的是安静对照组，而Kir6.2的表达量则出现相反的趋势，耐力运动组的表达水平都比安静对照组高，其中B组较其它三组Kir6.2表达量都要高，三个耐力运动组之间的表达无显著性差异；C组Kir6.2表达水平较A组和X组上调，无显著性差异。中强度组较安静对照组达标水平上调具有显著性差异（P<0.05）。

3 结论

3.1 Kir 6.1的表达：四个组的表达量都不高，但安静对照组的表达水平与三个强度组相比要上调，运动强度与表达量成反比关系，Kir 6.2的表达：耐力运动组的表达水平都比安静对照组高，中强度运动组表达量最高。

3.2 耐力运动能抑制大鼠心肌细胞膜KATP通道亚基Kir6.1的基因表达，但能提高Kir6.2的表达水平，可能说明通过抑制Kir6.1的基因表达来参与心肌的保护作用。

[1]孙啸, 陆祖宏, 谢建明.生物信息学基础.清华大学出版社，2005.

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Effects of Endurance Exercise of Different Intensity on Expression of ATP-Sensitive Potassium Channel Subunit Kir6.1 and Kir6.2 Gene in Rat Myocardial Cell Membranes

DENG Yougui

(Nanhua Vocational and Technical School, Dongguan 523932, Guangdong, China)

邓友贵（1986—），硕士，中学体育二级，研究方向：体能训练与恢复。