Yap介导瑞芬太尼预处理促进肝切除小鼠术后肝再生

殷苏晴 朱 玲 杨瑜汀 崔 璀 高 雄 高 坡 焦英甫 杨立群

瑞芬太尼是临床麻醉中常用的阿片类镇痛药物。已有大量研究结果表明，瑞芬太尼对于肝脏手术过程中的相关脏器损伤具有一定的保护作用[1-2]，同时在一定程度上具有维持血流动力学稳定、缩短机械通气时间、保护肝功能等优点[3-4]。本课题组的前期研究首次阐明了瑞芬太尼对于肝脏缺血再灌注损伤的保护作用及其可能机制[5]。在肝再生模型中，70%肝切除后剩余的部分肝脏不可避免地遭受氧化应激损伤，瑞芬太尼在肝切除后的肝再生过程中的作用尚无相关研究。本研究旨在探讨瑞芬太尼预处理对于70%肝脏切除术后肝再生的作用及其可能机制，为临床围术期应用瑞芬太尼提供更多的依据和支持。

1 材料与方法

1.1 实验动物和材料 雄性BALB/c小鼠，6～8周龄，购自上海必凯实验动物有限公司。Ki-67(#12202)、Yap(#14074)、磷酸化Yap(p-Yap，#4911)、GAPDH(#97166)抗体均购自美国Cell Signaling Technology公司，Reverse Transcriptase反转录试剂盒购自日本TAKARA生物科技有限公司，TRIzol和实时荧光定量核酸扩增检测系统的SYBR GREEN购自南京诺唯赞生物科技有限公司。

1.2 70%肝切除模型的建立和分组 实验动物予适应性喂养1周后，将其随机分入对照组和瑞芬太尼组。瑞芬太尼组小鼠在肝切除前20～30 min于腹腔内注射瑞芬太尼30 μg/kg(剂量依据本课题组前期实验[6]结果)，对照组予等量0.9%氯化钠溶液。之后用异氟烷麻醉小鼠，并采用改良Higgins和Anderson法行70%肝切除术。依据观察时间点，分别在70%肝切除术后6、24、36、48、120、192 h收集小鼠的血清和肝脏标本。

1.3 肝体比 分别于70%肝切除术后6、24、36、48、120、192 h取血后摘取两组小鼠剩余30%的肝脏组织，计算肝体比。肝体比=相应时间点再生后的残肝湿重/小鼠基本体重。

1.4 Ki-67免疫组织化学检测Ki-67阳性细胞率 取70%肝切除术后24、36、48、120、192 h的肝脏组织，浸泡于4%多聚甲醛溶液中固定脱水、石蜡包埋切片，而后脱蜡至水。用双蒸水(ddH2O)清洗切片5 min×3次。将切片放入3%过氧化氢水溶液中，孵育10 min。用ddH2O清洗切片5 min×2次。用洗涤缓冲液清洗切片持续5 min。300 μL封闭液室温下封闭1 h。300 μL一抗4 ℃孵育过夜。洗涤缓冲液清洗切片5 min×3次。在切片上滴加2或3滴SignalStain Boost Detection Reagent(HRP，Rabbit #8114)，置于湿盒中室温孵育30 min。用洗涤缓冲液清洗切片5 min×3次。DAB显色。将切片浸入ddH2O中洗涤，复染、脱水、封片。两组各时间点每个样本选取4个光学显微镜高倍镜视野，应用Image J软件进行分析，计算Ki-67阳性细胞数所占比例(阳性细胞率)。

1.5 实时定量PCR检测表皮生长因子受体(EGFR)mRNA表达 采用TRIzol法提取70%肝切除术后6、24、36、48、120 h两组样本总RNA，并取1 μL于Nanodrop仪器上测量260/280 nm处的吸光度(A)值和RNA水平，通过TAKARA反转录试剂盒进行cDNA合成，反应条件为37 ℃、15 min，85 ℃、5 s，4 ℃。使用SYBR GREEN进行PCR，获得数据以相对定量(RQ)=2-ΔΔCT(CT为循环阈值)计算mRNA表达量，每个样本对应每个引物添加3个复孔以缩小加样误差。引物序列：GAPDH正义链5’-AGG TCG GTG TGA ACG GAT TTG-3’，反义链5’-TGT AGA CCA TGT AGT TGA GGT CA-3’；EGFR正义链5’-ATG TCC TCA TTG CCC TCA AC-3’，反义链5’-GCA TGG GCA GTT CCC TAA G-3’。

1.6 Western印迹法检测功能性Yap蛋白质表达 采用放射免疫沉淀试验(RIPA)组织裂解液加苯甲基磺酰氟(PMSF)、蛋白酶抑制剂、磷酸酶抑制剂的混合液提取70%肝切除术后120 h两组总蛋白质，二喹啉甲酸(BCA)测定蛋白质水平。依照每孔50 μg蛋白质用8%胶进行SDS-PAGE电泳。70 V、90 min转膜。置于5%牛血清白蛋白(BSA)4 ℃摇床过夜封闭。Yap(1∶1 000)、p-Yap(1∶1 000)、GAPDH(1∶10 000)一抗孵育，4 ℃摇床过夜。0.1%吐温20 Tris缓冲液(TBST)洗膜，10 min×3次。二抗(1∶10 000)室温孵育90 min。0.1%TBST洗膜，10 min×3次。显影。以GAPDH作为内参，分析Yap和p-Yap条带灰度变化。

2 结 果

2.1 瑞芬太尼预处理对肝切除术后小鼠肝体比的影响 瑞芬太尼组肝切除术后48和120 h的肝体比均显著高于对照组同时间点(P值均<0.05)，两组间肝切除术后6、24、36、192 h的肝体比的差异均无统计学意义(P值均>0.05)，见表1。

2.2 瑞芬太尼预处理对肝切除术后小鼠肝组织Ki-67表达的影响 两组肝切除术后24、36、48、120、192 h肝脏标本Ki-67免疫组织化学染色结果见图1。瑞芬太尼组肝切除术后36、48、120、192 h的Ki-67阳性细胞率均显著高于对照组同时间点(P值分别<0.01、0.05)，两组间肝切除术后24 h的Ki-67阳性细胞率的差异无统计学意义(P>0.05)，见表1。

2.3 瑞芬太尼预处理对肝切除术后小鼠肝组织EGFR表达的影响 瑞芬太尼组肝切除术后6 h的EGFR mRNA水平显著高于对照组同时间点(P<0.05)，两组间肝切除术后24、36、48、120 h的EGFR mRNA水平的差异无统计学意义(P值均>0.05)，见表1。

表1 两组小鼠70%肝切除术后各时间点肝体比、Ki-67阳性细胞率和EGFR mRNA水平比较

与对照组同时间点比较：①P<0.05，②P<0.01

红色箭头所示为Ki-67阳性细胞 A 对照组术后24 h B 对照组术后36 h C 对照组术后48 h D 对照组术后120 h E 对照组术后192 h F 瑞芬太尼组术后24 h G 瑞芬太尼组术后36 h H 瑞芬太尼组术后48 h I 瑞芬太尼组术后120 h J 瑞芬太尼组术后192 h 图1 70%肝切除术后不同时间点两组Ki-67阳性细胞率比较(Ki-67免疫组织化学染色，×20)

2.4 瑞芬太尼预处理对肝切除术后小鼠肝组织Yap和p-Yap蛋白质表达的影响 对照组和瑞芬太尼组肝切除术后120 h的肝组织Yap蛋白质相对表达量分别为1.039±0.117和0.978±0.099，差异无统计学意义(P>0.05)。瑞芬太尼组肝切除术后120 h的肝组织p-Yap蛋白质相对表达量为0.729±0.197，显著低于对照组的0.944±0.077(P<0.05)。见图2。

1～3 对照组 4～6 瑞芬太尼组 图2 Western印迹法检测70%肝切除术后120 h两组Yap和p-Yap蛋白质的表达

3 讨 论

围术期肝功能的保护和恢复是决定部分肝切除术后患者生存率的重要因素。诸多研究[7-9]已经证实了瑞芬太尼对于多种脏器具有保护作用。本课题组的前期研究[5]结果表明，瑞芬太尼诱导产生的一氧化氮(NO)可通过耗尽活性氧和抑制炎性反应而减轻肝脏损伤。此外，外周和中枢的迷走神经系统也参与了瑞芬太尼对肝脏缺血再灌注损伤的保护作用[10]。而在遭受外界一定程度的损伤之后，肝脏本身具有强大的再生能力，但目前尚无阿片类药物与肝再生有关的确切研究报道。本研究结果表明，瑞芬太尼预处理可促进70%肝脏切除后的再生过程，不仅表现为促进肝体比的增加和Ki-67阳性细胞率的升高，同时促进了肝再生早期EGFR的表达和肝再生过程中功能性Yap表达的增加，该结果可能提供了新的角度来审视临床瑞芬太尼的应用对于患者预后的影响。

本研究所记录的瑞芬太尼预处理时间为从腹腔内注射瑞芬太尼开始至70%肝切除手术结束，受实验操作过程的影响，预处理时间有一定的波动性，主要集中在20～30 min。为防止由瑞芬太尼预处理时间造成的差异偏倚，在本研究过程中对两组预处理的时间进行匹配。本研究中所采用的动物模型是肝再生研究中的经典模型，于1931年由Higgins等提出。既往研究[11]结果已经证实，70%肝切除后5～7 d，小鼠的肝脏就可以恢复到原始大小，因此本研究选择肝切除术后192 h作为研究终点，以明确瑞芬太尼促进肝再生的过程是促进其生理状态的肝再生，即只是加快了肝切除后肝再生的进程，并不会影响肝再生的结局。Ki-67的免疫组织化学检查结果显示，从肝切除术后36 h起剩余30%肝脏中增殖细胞的数量便显著增多，且到术后192 h时这种细胞增殖的状态依旧存在，这与肝再生后不同时间点肝体比的变化趋势基本一致。

在肝再生的过程中，肝脏细胞的周期进程受众多有丝分裂相关生长因子的影响，其中EGFR在肝再生中扮演着重要角色[12]，其配体作为肝细胞主要的促有丝分裂原，通过结合于相应受体激活Ras-有丝分裂原活化蛋白激酶(MAPK)信号和磷脂酰肌醇3-激酶(PI3K)/蛋白激酶B(AKT)信号通路，从而促进肝细胞的再生[13]。已有研究[14]结果证明，EGFR是肝再生初期肝细胞增殖的关键调节因子，在肝再生早期，其表达量显著增加[15]。在本研究中，肝切除术后6 h瑞芬太尼组EGFR mRNA表达水平显著高于对照组，可能因在一定程度上促进了早期的肝再生过程。

Hippo-Yap通路作为再生过程中的重要通路，参与多种器官再生修复的过程。而YAP的亚细胞定位受其磷酸化状态的调节[16]，p-Yap保留在细胞质中并不进入核内发挥其转录共激活因子的作用，从而被降解。已有研究[17]结果表明，Yap的过表达可直接促进肝细胞的增殖。对于肝脏而言，活化的功能性Yap在70%肝切除后显著增加，且其活化和核定位在肝再生的早期增加，并随着肝再生和肝体比逐渐接近术前水平而呈降低趋势[18]。

本研究结果表明，瑞芬太尼预处理可显著增加肝脏中活化的Yap的表达，与Ki-67免疫组织化学检查的结果相互印证，从而明确了瑞芬太尼促进肝再生的作用，提示瑞芬太尼预处理可能通过促进Yap的功能性活化从而促进70%肝切除后小鼠的肝再生。对于瑞芬太尼调节Yap活化的机制及其在促进肝再生过程中的重要性，尚需联系其上下游分子进一步研究。就其临床意义来说，瑞芬太尼可能会通过促进肝再生过程，使肝切除患者更早地恢复正常的肝脏体积和功能，从而改善患者的生存预后，但该结论尚需进一步的临床研究支持。